2022版外源基因在酵母中诱导表达操作流程Protocol-附高效酵母转化方法

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2022 版外源基因在酵母中诱导表达策略与操作流程Protocol-附高效酵母转化方法

Strategy and Protocol for induced expression of foreign genes in yeast

以GAL1为启动子的酵母表达质粒pYES2为例

实验材料：质粒 pYes2；酵母菌株：InvSc1 或W303-1A，W3031-B 或YPH499,YPH500

一、酵母生长与转化

酵母接种生长：新鲜接种酵母，在YPDA（货号YGM003A-52）平皿半固体培养基中划线生长，置于30度生长1-2天。YPDA平皿配制方法：称取50克，加水到1升（培养基按5%的量配制），20克琼脂粉（即2%），高压灭菌（121度，20分钟，高压灭菌结束待温度降到70度安全范围就打开取出，以免放在高压锅里闷得时间过长致使颜色变色，颜色变深是葡萄糖焦化增加的标志）
高效酵母转化（FunGenome High efficiency yeast transformation）：

（1）挑起单个克隆于10ml液体YPDA中生长，30度摇床震荡培养过夜。

（2）次日取出5ml加到200ml液体YPDA，30度震荡培养，记录初始OD600的值（可取出1ml测OD600），2-3小时后测OD600，待OD600=0.5-0.6后离心收集细胞（1000g离心10分钟），用无菌水洗一次，再离心，将水吸出

（3）加100ul 10xTE；100ul 10xLiAc；800ul无菌去离子水，摇床轻摇30-40分钟

（备注：LiAc和PEG4000都不能高压灭菌，只能过滤除菌，滤膜孔径0.22u）

（4）在1.5ml Ep管中加入下列成分：

A. 待转化的质粒1-2ug

备注：质粒取决于定量方法，往往定量方法不准确导致加入的质粒不准影响转化效率，FunGenome建议质粒DNA定量采用电泳定量法，而不宜用分光光度计，目前广泛使用的nanodrop定量法也时常相差巨大）

B. 运载体DNA 10-20ul（即Carrier DNA, 货号是YGM022C）。

备注：FunGenome运载DNA已经特殊处理，无菌、无DNA酶、无RNA酶（为方便记忆，可将其戏称“三无“产品）直接加入即可，不需要再煮沸处理。由于无菌和无DNA酶，因此只要没打开用过，可以室温保存一段时间，如果长时间保存还是-20C保存为宜。另外，由于无RNA酶（RNase），这个Carrier DNA还可以用于Northern预杂交处理。

C. 200ul 上面第（3）步准备的细胞

D. 100ul 无菌10xTE

E. 100ul 无菌10xLiAc

F. 850ul 无菌50% PEG4000（再次强调PEG4000不能高压灭菌，只能过滤除菌）。

30度摇床低速震荡30分钟。

备注：鉴于直立的1.5ml Ep管在加入上述成分后基本上没有多少空间了，即时提高摇床转速也难以达到充分混匀，因此建议将Ep横倒固定放置振摇以利于混匀，或将上述加样操作在50 ml无菌塑料离心管中完成后再置于30度摇床摇动30分钟（250转/分）

（5）42度热休克20分钟（期间5-10分钟摇动一次）

（6）室温放置2-3分钟后，10000g离心5秒（离心机转起来达到10000转就可以停止）

备注：如果前面加样和混匀操作是在50ml 离心管中进行的，次步就应转移到Ep管中一边后续离心方便快速

（7）吸出上清，加 0.5ml无菌水，吹起细胞，按照（6）的方法短暂离心，如此重复一共洗三次，以尽量出去PEG。最后一次离心吸出上清后，加无菌水1ml，轻轻吹起细胞混匀，然后取去加入平皿（如果转化pYes2，就用缺Ura的平皿；如果转化pYes3，就用缺Trp的平皿），30度温箱培养生长3天左右

备注：为确保获得生长的单克隆，建议多推布几个平皿，如100ul 推布一个平皿；200ul推布一个平皿；400ul再推布一个平皿等等……

【说明】有人在酵母转化时加DMSO和YPD plus，上述操作完全没有理会这些花样。实际上，加DMSO不但不能增加转化效率，反而会降低效率。另外，每次转化应该临时新做感受态，不宜将感受态冻存备用。加YPD plus本是想让热激后的酵母细胞缓口气，这纯粹是异想天开式自娱自乐，根本没有必要，也完全没有必要。其实，很多专门从事酵母遗传学研究的 Yeast Lab 采用的 lazy bone（懒骨头）不清除PEG的转化方法就足以说明酵母后续恢复生长无惧转化过程中的任何折腾。相反，如果过程中加YPD plus则会增加平皿中的非转化细胞背景。这就是本转化方法既不加DMSO（二甲亚砜），也不加YPD plus的道理。只要是在初始培养中使用的是YPDA，转化过程中根本不需要加YPD plus。（注意：这里指的是泛基诺YPDA，货号YGM003A-52。为什么不能用其他来源的YPDA代替？因为泛基诺YPDA经过特别优化处理）

二、诱导表达操作纲要

先在含2%葡萄糖的泛基诺Ura Minus Media （泛基诺规范化培养基SD/-Ura= Sc-Ura））培养基（货号YGM003A-3）中（备注：实验者自行加葡萄糖，按2%的比例），置于30度摇床250-280转/分钟震荡培养至OD600大约在1.2-1.4

3、1000g 离心5分钟弃上清

4、用200-300ml 泛基诺 Ura Minus Media（Sc-Ura，货号：YGM003A-3）不含任何糖的液体培养基悬浮细胞，充分混匀以洗涤细胞，离心弃上清。

5、加500ml（Sc-U：YGM003A-3）不含任何糖的培养基，继续震荡培养3-5小时，使细胞内的葡萄糖彻底耗竭（备注：葡萄糖是GAL启动子的强烈抑制剂，在微量葡萄糖存在的情况下，GAL1启动子驱动的基因均不会表达）

6、离心弃上清，换成新的500ml Sc-Ura培养基（YGM003A-3）同时加棉子糖和半乳糖（终浓度均是2%）继续震荡培养8-12小时。如果异源表达蛋白对酵母细胞来说毒性大，那么表达时间不宜超过5小时。（这里不应误解毒性的概念，即使常规蛋白对于异源细胞来说也具有一定的毒性）。应特别注意：棉子糖和半乳糖均不能高压灭菌，建议先配置40%经过滤除菌的无菌母液（泛基诺公司有售）。

备注1：有的实验室用某品牌半乳糖和棉子糖不能诱导表达，改用我们的双糖就成功了。客观地说，这是没有道理的，合理的解释是：实验用的半乳糖纯度不够（虽然商品标明纯度极高99%以上，尤其是原始进货渠道改变）。我们并不常规出售半乳糖和棉子糖，但为了方便实验者顺利开展工作少走弯路，我们专门准备了用于诱导表达的双糖系列产品：

半乳糖和棉子糖相关产品信息：

半乳糖：货号 GA001 包装 50克

棉子糖：货号 RA001 包装 50克

扩展1：如果采用表达载体pYes3，该载体含有Trp选择标志基因，对此，选择性培养基就应该用Trp Minus Media（Trp 缺陷培养基）货号为YGM003A-2