酵母遗传学研究（三）酵母接合型转换与酵母双杂交系统（Yeast Mating Type Switching and Yeast Two-hybrid System）

【精华】酵母接合型转换与酵母双杂交系统
Yeast mating type switching and yeast two-hybrid system

泛基诺技术总监  胡恩泛 
    

读者或和科研人员在接触酵母双杂交系统时，总会看到酵母细胞表型（基因型）的标记，如Mata或Matα，后面还紧跟一联串的小写标记基因符号如ura3,his3,leu2,trp1,ade2,can1-100。在查阅文献时，又苦于缺乏清晰而又系统的诠释资料，这对于初涉酵母实验的新手来说，简直是云里雾里。鉴于此，笔者便占用泛基诺博客一席之地对酵母基因型作一简要解释。
    

Mata或Matα是指酵母接合型（又叫交配型，英文是mating type），用于遗传学研究的酿酒酵母单倍体只有这两种接合型。a和α型单倍体可以交配形成二倍体a/α, 其表型兼有a和α型的特征； Mat后面的小写基因符号表示相应基因的突变表型。具体说来，ura3表示尿嘧啶合成途径的一个关键酶突变，带有这样基因型的酵母在缺乏尿嘧啶(Ura)的选择缺陷培养基（SD/-Ura）中不能生长，在同样的条件下，如转化了含Ura3野生型基因的质粒后或激活了报告基因Ura3（反向酵母双杂交系统）就能在SD/-Ura的选择缺陷培养基中生长了，这个现象目前已被广泛用来研究外源基因在酵母中的表达（这里不再赘述）。同样的解释，his3表示组氨酸合成酶的关键基因突变，leu2表示亮氨酸合成酶的关键基因突变，trp1表示色氨酸合成酶的关键基因突变，ade2表示腺嘌呤合成酶基因突变，相应的在选择缺陷培养基中的生长情况和筛选策略依次类推。can1表示编码精氨酸穿透（透过性）酶的基因突变，其表型与刀豆氨酸canavanine (一种植物来源的非蛋白氨基酸，精氨酸的结构类似物）抗性有关。
    

上一讲提到，酵母双杂交系统的建立本来是酵母遗传学研究的副产品，当初未曾料想这个系统对于生命科学研究的整体发展会产生如此巨大的影响。

酵母双杂交系统自八十年代建立以来已有几次改进，除了第一次改进增加报告基因没有涉及到酵母遗传学的额外知识，其他两次改进都增添了新知识（如接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统，后者还涉及到5-FOA的代谢问题）。
  

大概是在2001－2002年间，Clontech公司推出了接合（交配）型酵母双杂交系统。在这之前，一直是以AH109或Y187单倍体（备注：Y153,Y190,SCY90早期菌株，目前已基本Out了）为受体菌，先转化诱饵质粒，然后再转化文库，通过报告基因检测（如在四缺培养基SD/-Trp-Leu-His-Ade中）来筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行Mating。
  

我是在2002首次接触到交配型双杂交这个系统，这里还有一个小故事。当时我在美国宾州大学分子生物学系做酵母遗传学方面的research, 爱人在生物系做果蝇(Drosophila)遗传学方面的研究，和爱人同实验室的一个研究生在用酵母双杂交筛选相互作用靶蛋白时遇到技术问题询问怎么办（实验室的人都知道我爱人以前做过酵母双杂交），我爱人不仅没能帮助解决，甚至连讨论性回答都说不上来。晚上回来和我说起这事，我便问她以前做了那么久酵母双杂交，什么情况基本上都遇到过，怎么一点也回答不上呢？爱人说：他们用的那个双杂交方法怎么那样怪啊？用了两种酵母然后还要变成二倍体，没见过这阵势，真是一点也不明白。我听后也是一头雾水，纳闷着我是否Out了。第二天上班，爱人将我带到她所在的实验室，拿过说明书一看，原来如此啊，心里感叹美国人聪明，总是在不断地创新。交谈中得知学生遇到的问题是：效率低。这个效率问题应该是酵母接合效率的问题了。我当时研究的课题是酵母染色质沉默区HML和HMR基因调控机制，经常用到酵母接合型转换（Mating type switching）的实验技术，对常用酵母菌株之间的接合效率如数家珍，于是我滔滔不绝，然后又三言两语建议改用质粒文库转化，因为质粒转化效率是完全可以提高的，不同的酵母转化方法，其效率可能会相差十万八千里，而酵母Mating效率的提高几乎没有令人激动的空间。我随后还将High efficiency yeast transformation protocol发给我爱人让她转发，后来他们实验室还真的按我的建议做了，问题也解决了。这可让我赚足了面子，其实这只不过是雕虫小技。
    

不论用哪一种方法，在筛选文库之前一定要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因(即进行所谓的自激活检测)，这种情形下需要利用三缺培养基SD/-Trp-His-Ade来检测，以免产生所谓的I类假阳性。也许有的研究者遇到过这样的问题，好不容易通过酵母双杂交系统筛选到了阳性克隆，后来用GST pull-down和免疫