疾病相关基因的克隆策略

                       疾病相关基因的克隆策略

 1．从功能克隆到遗传分析

    20世纪40—60年代，许多研究生物化学和生物大分子的手段如电子显微镜、生物分子分离、提纯、蛋白质电泳相继出现，使人们在分子水平上研究疾病病因成为可能。许多酶缺陷的疾病就是利用这些方法将其基因确定的，如苯丙酮尿症等。功能克隆是基于疾病与正常之间明显可见的或直接与生化功能相关的线索确定与疾病相关的基因，主要是利用基因的产物蛋白质或RNA。但对于许多无法得到与疾病相关产物的情况，仅仅从疾病的表型特征几乎是不可能得到致病基因的，即使按前述方法得到了许多基因，人们也不可能得到每一基因的具体功能。因此，随着许多疾病研究的进行，人们逐渐认识到了遗传分析的优越性，至少人们可以获得从表型到基因型的直接联系。

 2.从定位克隆到候选基因关联研究

    随着人类基因组遗传图谱和物理图谱的制作，出现了“定位克隆”的全新思路，发现了包括囊性纤维化(cysticfibrosis，CF)、Huntington舞蹈病、遗传性结肠癌、乳腺癌等一大批疾病基因。但在多基因疾病研究中，由于关联研究相对于连锁分析的有效性?因此受到更多的重视。人类基因组序列图已公布，所有人类基因均被精确地定位于染色体的各个区域，使得候选基因关联研究成为可行。候选基因关联研究不仅提高了复杂疾病关联研究的统计学效率，同时也促进了对诸如表型、组织、基因和蛋白质等可能与疾病有关因素的了解。

 3．从单基因疾病到多基因疾病

    单基因疾病由于因素单一，基因型—表型关系清晰，已经形成了较为成熟的致病基因定位、分离技术体系，迄今已鉴定克隆了很多单基因疾病的致病基因。目前研究的趋势是更加注重对基因功能以及相关生物化学通路的阐明。由于基因组研究成果的不断改观和遗传统计分析方法的进展，目前国际上疾病基因组学的研究热点是多基因疾病。已知多基因疾病是由多个基因的累加作用和某些环境因素作用所致，这些基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNP)及其特定组合可能是造成疾病易感性最重要的原因。因此，对疾病相关调节通路的候选基因进行SNP的关联研究，可能是多基因疾病研究取得突破的希望所在。

    目前疾病相关基因的搜寻与克隆的研究策略依然主要采用关联研究和定位克隆，其他如全基因组扫描、全基因组关联研究、候选基因关联研究等策略和方法都是从上述两种策略衍生出来的。另外，尚有基于染色体异常和动物模型等一些方法和策略。但值得注意的是所采用的策略方法并非孤立，而是相互借鉴，综合应用。随着对基因组特性和各种策略方法认识的加深、新的研究方法的出现以及分型技术的发展和成本的降低，有助于阐明患病个体差异的根本原因，有助于探讨许多疾病的发病机制，因而能从根本上提供疾病的预防及个性化治疗。

    流行病学和遗传学研究表明，疾病是环境因素与遗传因素相互作用而形成的一种特殊生命过程。除了获得性疾病外，糖尿病、精神分裂症等常见疾病和血色素沉着病等罕见疾病的发病均与遗传因素密切相关，存在着遗传易感性(susceptibility)。即便是感染性疾病，感染与否亦与个体本身的遗传因素息息相关。根据涉及基因的多少，可初步把疾病分为单基因疾病(monogenicdisease)和复杂疾病(complexdisease)。单基因疾病是疾病发病的遗传因素中以单基因缺陷占主导地位，表现为单个基因的缺失或突变，且在家系成员中疾病的传递符合孟德尔规律者，也称为孟德尔遗传病。符合孟德尔遗传的单基因疾病约6 000多种，这类疾病多数症状明显，但发病率低，对人群的危害性不大。复杂疾病则是由多个基因及环境因素相互作用所致，在家系成员中疾病的传递不符合孟德尔规律，又称为多基因疾病(polygenicdisease)。肿瘤、冠心病、糖尿病、精神分裂症和高血压等疾病均属于多基因疾病，这些疾病发病率高，严重危害着人类健康。因此，定位克隆这些疾病的相关基因其社会意义重大，同时具有很大的现实和潜在的经济意义。

    人类基因组含2万多个基因，如何从众多的基因中搜寻到与疾病相关的基因，不仅是生命科学研究的难点，亦是研究的热点。由于单基因疾病遗传模式简单，涉及基因数少，多采用定位克隆(positionalcloning)方法，目前约有5 000多个单基因疾病的相关基因已被定位，并克隆出约1 300个致病基因。经典定位克隆的成功例子有血色素沉着病(hemochromatosis)、指甲髌骨综合征(nail—patellasyndrome)和乳糖耐受不良症(1actoseintolerance)等。

    定位克隆策略在单基因疾病上获得的巨大成功促使人们将这一研究策略应用于常见的复杂疾病。但迄今为止，对于糖尿病等大多数常见的多基因疾病，鲜有用定位克隆技术获得相关基因的成功报道。仅有的少数成功报道提示，严格选择研究样本有着重要意义，如采用发病年龄早的家系(接近孟德尔方式遗传)，成功的例子有发现BRACl和BRAC2在乳腺癌和卵巢癌中的作用，以及hMSH2基因突变与遗传性非息肉性结肠癌(hereditarynon—polyposiscoloncancer，HNPCC)的相关性；或采用隔离群体(减少遗传异质性)，内皮素受体B(EDNRB)第4外显子的一个无义突变是荷兰Mennonites地区先天性巨结肠(Hirschsprung’sdisease)的一个致病因素，以及过氧化氢酶基因启动子区-844 C／T多态与原发性高血压关联就是这样被发现的。

    多基因疾病相关基因研究进展缓慢，主要是因为与疾病危险性相关的突变往往在机体遗传因素和环境因素双重作用下，才导致机体发病，并且多基因疾病确切发病机制目前尚不十分清楚，以及存在着遗传异质性(heterozygosity)、种族差异等因素，这在客观上限制了多基因疾病易感基因的研究进展。