神奇的酵母遗传学研究（三）酵母接合型转换与酵母双杂交系统的发展

           神奇的酵母遗传学与高等动植物细胞基因研究（三）

             酵母接合型转换与酵母双杂交系统的发展

          Yeast mating type switching and new advance of yeast two-hybrid system

                        泛基诺技术总监  胡恩泛  

读者或和科研人员在接触酵母双杂交系统时，总会看到酵母细胞表型（基因型）的标记，如Mata或Matα，后面还紧跟一联串的小写标记基因符号如ura3,his3,leu2,trp1,ade2,can1-100。在查阅文献时，又苦于缺乏清晰而又系统的诠释资料，这对于初涉酵母实验的新手来说，简直是云里雾里。鉴于此，笔者便占用泛基诺博客一席之地对酵母基因型作一简要解释。  

Mat a或Mat α是指酵母接合型（又叫交配型，英文是mating type），用于遗传学研究的酿酒酵母单倍体只有这两种接合型。a和α型单倍体可以交配形成二倍体a/α, 其表型兼有a和α型的特征； Mat后面的小写基因符号表示相应基因的突变表型。具体说来，ura3表示尿嘧啶合成途径的一个关键酶突变，带有这样基因型的酵母在缺乏尿嘧啶(Ura)的选择缺陷培养基（备注：可记着SD/-Ura或写为SC-Ura，不能写为SD-Ura）中不能生长，在同样的条件下，如转化了含Ura3野生型基因的质粒后或激活了报告基因Ura3（反向酵母双杂交系统）就能在SC-Ura的选择缺陷培养基中生长了，这个现象目前已被广泛用来研究外源基因在酵母中的表达（这里不再赘述）。同样的解释，his3表示组氨酸合成酶的关键基因突变，leu2表示亮氨酸合成酶的关键基因突变，trp1表示色氨酸合成酶的关键基因突变，ade2表示腺嘌呤合成酶基因突变，相应的在选择缺陷培养基中的生长情况和筛选策略依次类推。can1表示编码精氨酸穿透（透过性）酶的基因突变，其表型与刀豆氨酸canavanine (一种植物来源的非蛋白氨基酸，精氨酸的结构类似物）抗性有关。  

上一讲提到，酵母双杂交系统的建立本来是酵母遗传学研究的副产品，当初未曾料想这个系统对于生命科学研究的整体发展会产生如此巨大的影响。

酵母双杂交系统自八十年代建立以来已有几次改进，除了第一次改进增加报告基因没有涉及到酵母遗传学的额外知识，其他两次改进都增添了新知识（如接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统，后者还涉及到5-FOA的代谢问题）。

大概是在2001－2002年间，Clontech公司推出了接合（交配）型酵母双杂交系统。在这之前，一直是以AH109或Y187单倍体（备注：Y153,Y190,SCY90早期菌株，目前已基本Out了）为受体菌，先转化诱饵质粒，然后再转化文库，通过报告基因检测（如在四缺培养基SC-Trp-Leu-His-Ade/英文TrpLeu HisAde Minus Media 货号：YGM003A-9）来筛选与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白。接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再与转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行Mating。

我是在2002首次接触到交配型双杂交这个系统，这里还有一个小故事。当时我在美国宾州大学分子生物学系做酵母遗传学方面的research, 爱人在生物系做果蝇(Drosophila)遗传学方面的研究，和爱人同实验室的一个研究生在用酵母双杂交筛选相互作用靶蛋白时遇到技术问题询问怎么办（实验室的人都知道我爱人以前做过酵母双杂交），我爱人不仅没能帮助解决，甚至连讨论性回答都说不上来。晚上回来和我说起这事，我便问她以前做了那么久酵母双杂交，什么情况基本上都遇到过，怎么一点也回答不上呢？爱人说：他们用的那个双杂交方法怎么那样怪啊？用了两种酵母然后还要变成二倍体，没见过这阵势，真是一点也不明白。我听后也是一头雾水，纳闷着我是否Out了。第二天上班，爱人将我带到她所在的实验室，拿过说明书一看，原来如此啊，心里感叹美国人聪明，总是在不断地创新。交谈中得知学生遇到的问题是：效率低。这个效率问题应该是酵母接合效率的问题了。我当时研究的课题是酵母染色质沉默区HML和HMR基因调控机制，经常用到酵母接合型转换（Mating type switching）的实验技术，对常用酵母菌株之间的接合效率如数家珍，于是我滔滔不绝，然后又三言两语建议改用质粒文库转化，因为质粒转化效率是完全可以提高的，不同的酵母转化方法，其效率可能会相差十万八千里，而酵母Mating效率的提高几乎没有令人激动的空间。我随后还将High efficiency yeast transformation protocol发给我爱人让她转发，后来他们实验室还真的按我的建议做了，问题也解决了。这可让我赚足了面子，其实这只不过是雕虫小技。  

无论是用基于质粒高效转化法定筛选，还是用低效的酵母接合（Mating）实验，在筛选文库之前一定要检测诱饵质粒转化后，看表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因(即进行所谓的自激活检测)，这种情形下需要利用三缺培养基(Trp His Ade 缺陷培养基即Trp His Ade Minus Media)来检测（三缺货号是YGN003A-18），以免产生所谓的I类假阳性。也许有的研究者遇到过这样的问题，好不容易通过酵母双杂交系统筛选到了阳性克隆，后来用GST pull-down和免疫共沉淀证实全是阴性，在实际工作中应该避免这种情况发生，就必须在大规模筛选之前做自激活检查。另外，由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达（leaky expression），这就是所谓的II类假阳性。如何消除II类假阳性？一般情况下，在培养基中加入终浓度为25mM的3-AT可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达，特殊情况下3-AT的浓度需要加大到45mM才能有效抑止渗漏表达，从而减少假阳性。排除或减少II类假阳性的具体做法是：转化诱饵质粒后用不同浓度的3-AT筛选，选择能抑制在Trp His Ade平皿中生长的3-AT最低浓度，3-AT浓度摸索可选择在5mM-50mM（m mol/L）之间做浓度梯度实验，选择刚刚能抑制生长的3-AT浓度。浓度过高不仅完全抑制II类假阳性克隆，而且也会抑制真正互作的阳性克隆。经过了上述一系列排除I类假阳性和II类假阳性实验摸索，最后进行质粒文库转化酵母或两种接合型酵母（诱饵酵母与文库酵母）进行接合交配就可以在-Trp-Leu-His-Ade+3AT+X Gal平皿中筛选（3-AT有高浓度的无菌储存液，货号是YGM003C-1）备注：不同公司的诱饵载体和猎物载体由于选择标记基因不同，所用的选择缺陷培养基也不同，如有的系统采用报告基因Ura，这种系统就要用到-Trp-Leu-His-Ura）。排除假阳性最后一道防火墙是：挑起大而饱满的克隆。

   如果检测到诱饵蛋白自身就能激活报告基因时怎么办？这就是所谓的III类假阳性。在这种情况下是否就不能再利用酵母双杂交系统从文库中来钓鱼呢？笔者在前些年的研究工作中就遇到这样的情况。怎么办？改用其他蛋白质相互作用的方法钓基因？别说前些年，就是今天，酵母双杂交技术仍然是不可替代的发现相互作用靶标的首选方法。笔者的解决之道是：用生物信息学方法分析诱饵蛋白结构域，将诱饵蛋白潜在的具有AD功能的结构域用缺失突变的方法敲掉，然后重新构建诱饵载体，这一招还真的灵光。详细方法如有时间将在今后的泛基诺博客中继续交流，读者不妨保持关注。

   写到这里，似乎可以收笔了，但意犹未兴，还有一类假阳性姑且称作是IV类假阳性。呵呵，四类（死类），不吉利呀。这类假阳性用上述解决III类的办法也无济于事，所以我们将它戏称为死假阳DFP（dead false positive）。这类假阳性产生的根本原因是细胞内诱饵蛋白和目标蛋白的表达量过高。我们知道，诱饵载体和猎物载体的启动子都是ADH，而ADH是酵母细胞组成型强启动子，启动子的 强效性和组成型的 聚积性使得待研究的蛋白质水平远远高于体内的真实水平，也就是说这类假阳性是系统本身造成的，因此无法克服。这也可以解释很多研究者在经过一系列排除假阳性实验后最终得出的所谓阳性克隆，在被后续其他实验手段严明正身时仍然是假阳性的困惑。因为体内蛋白质之间的相互作用是在极其微量的情况下发生的，酵母的高水平表达使原来相互作用的量化基础成千上万倍地放大了。目前所有版本的酵母双杂交系统都存在这一缺陷，要解决这一问题，就要对酵母双杂交系统进行实质性改造而非改良。泛基诺研究人员利用酵母接合位点（Mating type locus）两侧沉默区HML和HMR基因调控的原理开发出一套全新的蛋白质相互作用系统，使得蛋白质可以保持在低水平的条件下检测到相互作用的存在。

   现在，回头再来谈酵母接合型话题。前面已经提到酵母接合型位点两侧是HML和HMR沉默区，基因沉默机制的研究一直是生命科学研究的热点，也是医学科学表观遗传特征研究的热门话题，如肿瘤相关基因的沉默与激活等等。因此，泛基诺博客即将开设表观遗传学高级讲座系列，由泛基诺技术部技术支持陈博主讲，特此预告。（附言：陈博是泛基诺技术部客户经理，很多客户都很熟悉，他理论知识丰富，技术娴熟，被大家称为万能技术支持）。不过，我的【神奇的酵母遗传学研究系列讲座】仍然是未完待续-----