基因功能研究策略和方法系列讲座：酵母异源基因功能互补

首页标题 ꄲ 博客 ꄲ 基因功能研究策略和方法系列讲座：酵母异源基因功能互补

基因功能研究策略和方法系列讲座（一）酵母异源基因功能互补

作者：泛基诺技术总监 胡恩泛（笔名）

曾几何时，我在给研究生讲授细胞与分子生物学课程总论部分时，第一节课开始便打出如下的一张幻灯片：

Unity and Diversity of Cells

Your next-door neighbor has donated $100 in support of cancer research and is horrified to learn that her money is being spent on studying brewer’s yeast. How could you put her mind at ease?

【细胞的同一性和多样性】问题：邻居捐给你100美元用以资助癌症研究，当其得知你将捐款用于酿酒酵母的研究时感到非常愤怒。你如何给出一个让捐款者心安的解释?

在一段看似思维混乱的开场白之后，我便寻着自己的思绪度步讲台开始讲述，全然没有考虑自己是在讲课且面对的是初出茅庐的研究生。

近一百年来生命科学最重要的成就是什么？有人说是PCR，有人说是siRNA……。不，它们都算不上，它们仅仅是局部技术和局部理论而已。记得泛基诺博客系列中曾有一篇博文关于从模式生物科学的进展看创造论与进化论的百年之争，一语道破近一个世纪以来生命科学最辉煌的成就。有趣的是，不同种类生物基因序列相似性的庞大数据库既不支持进化论，也不支持创造论，因为看似支持进化论的基因同源性和相似性分析结果也正是上帝这个造物主节俭原则的生动写照。

知道某种生物基因组序列是一回事，而怎样理解这些序列则完全是另一回事。到目前为止，基因组功能的研究仍然局限在对于单个基因的研究积累，功能基因组研究是雷声大雨点小（实际上连雨点也没有下），所谓高通量筛选法（如基因芯片、蛋白质芯片和质谱等）根本就称不上是基因功能研究的工具。

那么，基因功能究竟如何研究？要回答这个问题，首先需要了解有哪些方法可用于基因功能的研究。现将目前常用的一些套路归纳如下：

1、过表达（over-expression）：包括细胞水平和整体水平过表达，前者实际上就是表达质粒的转染或病毒感染的方法，后者主要指转基因动物；

2、抑制表达和基因敲除：前者包括反义技术和RNA干扰（RNAi）技术，有人称之为敲减（knock down），后者主要指基因敲除（knock out) 动物，当然会折腾的实验室也可能会利用细胞作为终极模型来研究，不过需要进行两次基因敲出，唯一例外是利用酵母（这在下面将专门讲述）；

3、显负性突变技术：又称显性负突变或显性抑制技术，这种方法一般的实验室可能不会想到去用它，但这种方法却是那些有浓厚的遗传学思想实验室的最爱，近年来影响因子比较高的期刊杂志上将RNAi与显性负突变技术综合应用的文章逐渐增多，大有成为主流的趋势。这种技术从实质上来讲应归于2)类，但由于其方法的经典性和思想的正统性，故将其单独列出；

4、遗传改造：用基因工程手段定向复制特定生物模型；

5、寻找相互作用伙伴（interaction partner)：注意这里用的是伙伴而不是伴侣，因为分子伴侣(molecular chaperon)另有自己的一片天空。具体方法就是大名鼎鼎的酵母双杂交和酵母三杂交系统，还有配套的GST pull-down及免疫共沉淀；

6、异源基因功能互补：这就是本文将要重点阐述的一类方法。

在各种模式生物中，人们对酵母的研究无论从历史的角度还是从学术深度上都是其他模式生物所不能比拟的。有一种叫Genetics的杂志，早年在生命科学界的影响是很大的，其中刊登的绝大多数文章基本上都是关于酵母遗传学方面的。同类杂志还有Current Genetics，Yeast等。酵母成为最受欢迎的模式生物是由它本身的特性决定的。首先，酵母是微生物中的真核生物，而真核生物基因在进化上具有高度的保守性，这就使得科学家利用酵母来研究高等动物和植物的基因功能在理论上成为可能；其次，酵母的遗传背景经过多年的研究已经清晰地展示在世人面前；再次，酵母基因组简单，尤其是酵母为单倍体，这就为酵母基因删除提供了极大的便利（注意：对于酵母一般不用基因敲除这个词，而是用基因删除，英文是：deletion）

说到酵母基因删除，其经典方法不能不提，那就是“一步基因中断法”（One-step gene disruption），泛基诺技术部研究人员经常采用的就是这种方法，泛基诺公司承接酵母突变株研究课题时首选的也是这种方法。酵母基因删除还有一种简单的方法叫PCR介导的基因删除。为什么后一种方法简便，泛基诺技术部不采用它而舍近求远呢？这主要是效率问题，更重要的是经验问题。

利用酵母研究异源基因功能互补（functional complementation）主要有两个方面：1、克隆高等动、植物同源基因：已知酵母的特定基因克隆其他物种同源基因。这种情形首先需要建立兴趣物种基因表达库，建库时必须以酵母表达质粒为骨架，一般用ADH作为启动子。早期克隆的很多细胞分裂相关基因如CDC系列和细胞周期素Cyclin系列基因等就是用这种方法获得的，有人将这种方法生动地称之为基因拯救（gene rescue)。鉴于酵母分子遗传学对高等生物细胞周期调控的启示及其对于整个生命科学研究的卓越贡献，研究先驱——Paul和Nurse，荣获二十一世纪首届诺贝尔生理医学奖，可谓众望所归，光照全球。2、功能验证：探究高等动植物特定基因是否为酵母已知功能基因的同源基因，注意要点与前面相同。3、疾病基因筛选：利用功能互补筛选功能突变体，发现突变热点。这种方法已成功地用于Rb和p53基因的研究和突变筛查（相关文章可参阅美国科学院院刊）。

利用功能互补法研究高等动物、植物和人类基因功能的前提是首先获得酵母突变株。酵母突变株有多种类型，但用于遗传学研究的主要有单突变和双突变。如果酵母的相应基因是必需基因（英文：essential gene)，那么情况就比较复杂了。在这种情形下，就要分离条件突变株。遗传学研究中常用的条件突变株是温度敏感突变株（temperature sensitive mutant，简称ts mutant) 。这种ts突变株在30度可以生长而在37度不能生长。分离特定基因温度敏感突变株的工作可以称得上是一个复杂的工程，如果不是一个正统的遗传学实验室，那么就连想也别去想，因为那不仅仅是一个消耗时间的问题，更是一个消耗意志的问题。分离ts突变株的技术路线如下：1）构建野生型目的基因（your favourite gene，经典参考文献上简称为YFG）酵母表达质粒（含Ura3筛选标记），转化野生型酵母，在尿嘧啶缺陷的培养基（Sc-Ura)中筛选转化克隆。2）删除酵母基因组中野生型YFG（采用基因敲除法：One-step gene disruption或PCR-mediated gene deletion)。3）构建含Trp1或Leu2标记基因的YFG酵母表达质粒，在羟胺的作用下生成突变库并进行二次扩增后转化上一步获得的转化子（在Sc-Trp-Ura培养平皿中筛选)，酵母转化克隆的筛选如同酵母双杂交培养基的选择。4）用5-FOA反向筛选法丢失含Ura标记基因的质粒。5）用Stamping法复制平皿分别各置一份于30度和37度培养，挑取在30度能够生长而在37 度不能生长的克隆进行基因表型鉴定。上述过程叫Plasmid shuffling (备注：不能翻译为质粒穿梭，质粒穿梭是Plasmid shuttle)，到目前为止，尚没有这个技术名称的中文翻译。姑且让我暂定为“质粒拖曳”技术吧，这好比是我们用鼠标将桌面上的文件从一个位置拖到另一个位置。Plasmid shuffling 或可称之为质粒洗牌技术，显然，这一称谓远不如质粒拖曳来得贴切，因为拖曳将过渡质粒拖走了，而洗牌则还是留下了一切。上述过程写起来就有点绕，做起来更是挫败感不断来袭。