ChIP-seq 理论与实践应用

ChIP-seq 理论与实践应用 

ChIP-seq，指的是结合位点分析法，作用为研究体内蛋白质与DNA相互作用。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。

将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

中文名  结合位点分析法

外文名  Chromatin Immunoprecipitation，ChIP

简    称  ChIP-seq

作    用  研究体内蛋白质与DNA相互作用

技术支持 染色质免疫共沉淀技术

主要应用 转录因子结合位点、组蛋白特异性

目录

1.       ▪ 技术路线

2.       ▪ 实验流程

3.       ▪ 生物信息分析流程

4.       1 研究内容

1.       ▪ 测序

2.       ▪ 基本数据分析

3.       ▪ 高级数据分析

4.       2 技术特点

1.       3 应用领域

2.       4 案例分析

技术路线

实验流程

（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；

（5）将准备好的样本进行深度测序。 [1] 

实验流程示意图 

生物信息分析流程

生物信息分析流程示意图 

研究内容

测序

对客户提供的ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。

基本数据分析

数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。

高级数据分析

（1）ChIP-Seq序列与参考序列比对；

（2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）；

（3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度；

（4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释；

（5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。

技术特点

应用领域

由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：

（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；

（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；

（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；

（4）CTCF转录因子研究。

案例分析

Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技术，发现：家猪IGF2基因（编码Insulin-like growth factor 2）第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达（表达量是正常情况的3倍），这一突变主要影响肌肉生长（提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3~4%）、心脏增大和脂肪沉积。

ZBED6基因与ZBED6蛋白

ZBED6基因：是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。Real-time-PCR分析显示，小鼠Zbed6 mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。

ZBED6蛋白是首次报道。ZBED6蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域；第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号（富Lys-Arg区段，KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI）。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中（包括家猪）显示出~100%相似性。

ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的方式

用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6基因沉默后的相关实验结果，证实了ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于Igf2基因第三内含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位点结合来抑制Igf2基因的表达。当Zbed6基因沉默后，Igf2基因的表达量升高、细胞增殖（肌管形成）加快、创伤愈合加快。

为了研究ZBED6蛋白作用靶点（Igf2基因及其下游基因），作者采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析。AB SOLiD测序得到：

①24million reads（比对到小鼠基因组上），2,499 Peaks；大多数峰（Peaks）集中在Igf2基因内含子中的QTN位点，即，QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点（图1）。

②GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用（图2）。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH（basic helix-loop-helix）家族，10个属于FOX家族，8个细胞核受体，7个属于SOX家族（图3）。

综上所述，IGF2基因突变的家猪和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌细胞的表型效应、高度的序列保守、核定位、广泛的组织分布、许多靶基因有重要的生物学功能，这一系列现象说明：在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和生长。

图1

图1 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（A）Igf2基因内含子QTN位点ChIP-Seq Peak分布

图2

图2 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（E）Gene Ontology分类

图3

图3 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（F）ZBED6蛋白结合的转录因子家族