《Science》经典解析：RAD51是Dmc1介导的减数分裂联会分子形成的从属性因子

       RAD51是Dmc1介导的减数分裂联会分子形成的从属性因子

【研究背景】

减数分裂的意义是使亲本染色体数目减半以确保双亲生殖的子代染色体数目与父本或母本相同而不会倍增。

由于做有丝分裂周期这方面研究的人很多，因此，生命科学研究者对细胞有丝分裂周期的调控已广为熟悉。

减数分裂的调控元件（machinary）与有丝分裂的元件是共有的，减数分裂版本是有丝分裂的修饰版，这种修饰主要是由通过细胞内的一些关键蛋白（如Rec A 家族成员Rad51和Dmc1）来实现的。

Rad51和Dmc1与单链DNA束（DNA tracts）结合，通常在DNA双链断裂（ doubl2-strand break 简称DSB）旁侧形成核蛋白丝。核蛋白丝的功能是在DSB附近搜寻可供配对的非断裂的染色体或同源分子（备注：寻找模板时，姐妹染色单体优先于同源分子被使用）并将包裹以形成联会分子（joint molecules, 简称JM）。

Rad51是唯一在有丝分裂周期中形成联会分子中发挥作用的蛋白，而Dmc1则是减数分裂特异性调控蛋白。减数分裂过程中的重组既依赖于Dmc1，也需要借重Rad51。

已有研究表明：Rad51和Dmc1具有执行同源序列搜寻和形成联会分子的功能，然而，是否其中之一或两者同时在减数分裂的联会分子形成过程中做贡献则未有报道。

【知识储备】

【理论知识】大肠杆菌RecA蛋白有两个DNA结合位点：

Site I: 高亲和的DNA结合位点：促使二聚化的RecA与单链DNA束（ssDNA tracts）结合形成核蛋白丝

Site II： 低亲和的DNA结合位点：促使和蛋白丝与另外的双链DNA结合以搜寻同源DNA形成联会分子（示意图Fig.1A 有助于对这一过程的理解）

Site II 含有三个带正电荷的氨基酸残基：第243位精氨酸Arg （R243）、第245 位赖氨酸Lye （K245）、第227位精氨酸Arg （R227），它们构成螺旋槽的延伸结构。

酵母同源蛋白Rad51的R188、K361、K371与RecA的上述三个氨基酸残基相对应（见Fig.S1 B）

（补充基础知识：自然界20中氨基酸中只有三种氨基酸在水溶液中带正电荷，它们是：赖、精组。）

【实验知识】

1、       荧光偏振分析：小分子荧光与大分子结合后在激发光作用下处于激发态，发出荧光，结合大分子越多荧光越强，游离的小分子越多荧光就越弱。因为结合大分子的荧光物质限制了荧光漂移。

2、       EMSA：电泳涌动迁移分析，简称Gel shift。同位素标记的DNA与蛋白质结合后，电泳变慢，通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。电泳结束后，贴上滤纸，在蒙上一层薄而透明的保鲜膜进行真空干燥（摄氏度80C），贴上X光片，放射自显影（自己配制显影定影液）。放射自显影结果：在最前沿是游离的同位素标记的ssDNA，在最前沿与加样孔之间是不同的蛋白质分子数与同位素标记的DNA结合的复合物，不同大小代表结合的分子数不同。

【本文工作】主要围绕Rad51 site II 三个氨基酸突变（突变为丙氨酸Alanine，简称A）突变为Rad51-II3A后的生化特性和细胞表型依次展开：

首先：看Rad51-II3A site I 的DNAbinding activity

其次：看Rad51-II3A site II 的DNA binding activity

再其次：看Rad51-II3A在形成联会分子过程中D-loop 形成能力的变化

然后：看体内（In Vivo）即在细胞内看DNA binding activity: 借助突变株与野生型的对比看细胞内的核定位情况（用DAPI进行蓝色核染以确认细胞核 的位置）和DSB处的富集（foci）。

再然后：看细胞内联会分子活性的变化（采用独特的游丝分裂研究模型：电离辐射损伤修复模型。备注：电离辐射导致DNA双链断裂即DSB，从而产生DSB诱导的同源修复）

进一步：看这种有丝分裂性质的联会分子的活性对于减数分裂同源重组来说是否是必需的（necessary or essential）？ 方法：图距测量、基因转换频率测定、删除干扰试验（这三个试验都是测定分子间的重组效率）

       检测结果：Rad51-II3A 不影响分子间同源重组事件（IH）

       推论：Rad51 联会分子活性（JM activity）与减数分裂重组无关

进一步补充：以前的研究表明，Rad51基因删除（也就是敲除，以   表示）严重影响分子间重组倾向，以IH/IS 比值来衡量

知识备注：IS是指姐妹染色体之间的分子交换，IH是指同源分子之间的交换。细胞执行功能时通常以未断裂的姐妹染色单体交换为优先选择。

进一步补充结果：与Rad51   的表型相反，突变的Rad51-II3A与野生型WT Rad51的IH/SH比值相同，这进一步证实Rad51的JM活性对于减数分裂重组无贡献。

再进一步补充：另加一个对照试验来证实突变Rad51-II3A 缺乏减数分裂重组的活性，作者采用hed   dmc1 这个双基因删除细胞（虽然是基因删除，但习惯上也叫mutant，基因缺失也是一种突变）。作者说这个突变株的背景是Rad51只贡献交换活性（我不清楚这个突变株的背景为何是这样，这由作者说了算）。结果：野生型Rad51促进高水平JM的形成，但突变的Rad51-II3A 显著阻断减数分裂中野生型Rad51依赖的JM（见图Supplement Fig. S6）

因此得出结论：Dmc1的形成JM的活性对于正常减数分裂中分子间同源配对（简称为IH，全称是interhomolog）是充分的（sufficient）。

接下来追问：Dmc1的JM activity（形成联会分子的活性）对于减数分裂是否是必要的（necessary）?

为此构建了：Dmc1-II3A突变株，结果发现这个突变株减数分裂阻滞以及JM形成被阻断，这正

与dmc1   的表型相同，见Supplement Fig. S7）

为此得出结论：Dmc1形成和蛋白丝的能力不足以维持分子间重组的功能，这与Rad51形成相反的对比（Rad51形成和蛋白丝的能力足以形成分子重组，因为Rad51-II3A能形成和蛋白丝且不影响分子重组事件）。这是细胞水平的实验结果。作者还进一步用生化实验证实了：Dmc1-II3A 保留了DNA binding 的活性，但没有D-loop 形成的活性，这与Rad51-II3A的特性是一样的（见Supplement Fig. S8）。

最后：鉴于Rad51在联会分子形成过程中JM的 同源分子偏向性（bias）不依赖于它的链交换活性，以及Rad51促进Dmc1的foci（这个foci可理解为功能定位）这些事实，这意味着Rad51在减数分裂过程中的贡献不是主要的，是从属于Dmc1的，充其量也就是调节Dmc1的链交换活性。那么，最后接下来的工作就是如何证实Rad51的调节作用？设计这样的实验，困难不小。但基于已有的事实：异源二聚体Mei5-Sae3在细胞内能刺激Dmc1的功能，所以，作者便想出这样一个实验：将体外用纯化的蛋白系统，在Mg2+和ATP存在下，将Rad51加到Mei5-Sae3一起会对Dmc1的D-loop活性是否有可观察到的刺激效应？

      Fig.4 A是三组成分加减组合，Fig.4B是Rad51-II3A 突变的对照版

      Fig.4 A lane 8 但加Mei5-Sae3则有抑制作用（Fig.4 A lane 2 相比），而另加Rad51-WT（野生型）则能反转Mei5-Sae3的抑制效应（Fig.4 A lane 10）。 

突变的Rad51-II3A也能刺激Dmc1的D-loop活性（Fig.4 B lane 10-12），有趣的是，降低突变的Rad51-II3A 的浓度，其刺激效应并没有随着大幅降低，推测Rad51 丝槽中三个带正电荷的氨基酸被去除后可增强突变型的Rad51-II3A与Mei5-Sae3的相互作用 （参考文献16有进一步论述），与此推论一致，有研究模型证实：Mei5-Sae3 与丝槽结合。

最终结论：Rad51与Mei5-Sae3一起作为一个中介物（Mediator），为Dmc1的链交换活性提供支持（support）。这与下面观察到的现象是一致的：Mei5 ,Sae3，Rad51对于Dmc1在减数分裂过程中实时处于正确的位点（foci）是必须的。但Rad51的同源配对倾向是否以及如何参与Mei5-Sae3依赖的刺激Dmc1的D-loop活性仍然不明，有待于进一步研究。

『图表分析』

图一：A 荧光偏振分析 这很好理解。实验原理见本逐节第一页

B 有两个图：左边是单链DNA结合分析（下边是对应的数据化处理）

            右边是双链DNA结合分析（下边是对应的数据化处理）

C 电镜图： 野生型和突变型Rad51形成和蛋白丝在长度和深度上没有差异，但在补充材料的S 图中 宽度有差异（参看《Science》的补充材料）

D:在与ssDNA 形成和蛋白丝的基础上，观察结合双链DNA的特性（差异说明见Science正文）

图二：野生型和突变性Rad54对D-loop活性的影响  以及Rad52、Rad54对反映的影响。这个应该没有什么困难，知道EMAS原理，直观地看，在结合Science正文已经告诉差异在何处。也没有问题。

图三：表型分析

      A：电离辐射（gamma-ray）照射后生存分析，一目了然，没什么好解释的

       B: 遗传图距测量 这个对于一般实验科学家来说比较新鲜，你就看结果就行了，两个字：No differences

      C: DNA 双向电泳（2-D）followed by Southern blot 这是检测DNA复制或修复合成的经典实验，看复制叉/泡的差异（babble）

      D: IH 和IS比较，一目了然

      E:减数分裂延迟效应

图四： 在中文正文最后有较多的说明。可以在参考英文原文的说明，正文说明变化，图注只说明谁是谁）

【补充材料】表格中有很多酵母基因型。双冒号是等位基因或人工基因插入处。HisG是第二代基因删除工具，就是过去大名鼎鼎的gene blaster，用来基于同源重组的基因删除。现代化的年轻人现在以很少用了。第三代基因敲除是PCR介导的gene deletion。现在是的第四代就是CRISPR/Cas9，这对于酵母研究来说纯粹是二逼玩法，因为酵母基因组容易操作，第一代的一步基因中断法（One-step gene disruption）不仅最可靠,也是较为简单的方法（因为较密单倍体易于操作），酵母遗传学采用基因编辑好比是捡到一粒生芝麻丢了一个熟西瓜，那是文艺青年和二逼青年干的事。