miRNA引物设计原理图解与应用举例

                     miRNA引物设计原理图解与应用举例

随着外泌体研究的火热，miRNA的研究又变得多样化，而研究miRNA最基本的，莫过于设计miRNA的引物。先给大家介绍最常用的茎环法设计引物。
miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在23bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，我们可以将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来23bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物。
具体操作：逆转录反向引物
以has-miR-145为例设计引物，其成熟体序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU。每个反向引物都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环。固定序列为：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’。
在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是has-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列，就是GAAUCCCU的反向互补：AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列为：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3’
 PCR引物：
正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定序列为：
ACACTCCAGCTGGG
在这个序列后加上成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除后面六个碱基序列为：GUCCAGUUUUCCCAGGA，把U变成T即可，最后的序列为：

5’-ACACTCCAGCTGGG GTCCAGTTTTCCCAGGA-3’
 
这样我们就得到has-miR-145的正向F引物和反向R引物了。在做实验时，用R引物将RNA逆转，再用F+R进入PCR程序。
 
当然，直接在茎环上取一段即可设计跑PCR的下游通用引物。如：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA -3，这个就更简单了，不过本人还是用特异性逆转录引物比较多。
U6的正反向引物分别为
F-CTCGCTTCGGCAGCACA；
R-AACGCTTCACGAATTTGCGT。

                            miRNA引物茎环引物设计原理示意图

miRNA设计方法
引物有两种类型，一个是poly加尾，一个是加茎环结构。
1. 关于miRNA引物设计（茎环法）：
由于mir在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物。
需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长mir的）+实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物
逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成，5’端茎环结构通常固定，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。
3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
固定的颈环序列（5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’）+mir末端6-8个反向互补碱基。
2. 上游引物：包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
3. 下游通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’ （茎环引物上取，可以挪）这个就更简单了，直接在颈环上摞一段即可，然后计算下gc。

链接：https://www.omicshare.com/forum/thread-775-1-1.html
miRNA的网站：http://www.mirbase.org

引物设计问题软件： http://mirbase.org/
这个软件可以直接查询miRNA序列，非常简单。
直接把U换成T。就这样搞定了上游序列，下游序列是试剂盒自带的。内参根据细胞来源的组织类型来定。

miRNA的加尾法逆转录和qPCR
有个问题经常被问到：做miRNA的逆转录，但只有普通的mRNA逆转录试剂盒，可以通用吗？看了下面的详细介绍，就会对答案有所了解
  “miRNA与mRNA的在qRT-PCR过程有所不同”
 
一般来讲，mRNA比较长，其长度通常在几百至几千个核苷酸，因此使用随机引物(Random Primer p(dN)6)即可随机结合到mRNA的各位置进行逆转录。由于qPCR的过程只需扩增目的片段的一部分(80~200 bp)，因此使用随机引物的逆转录产物尽管不完整，也完全能够满足qPCR的需求。当然，也可以使用Oligo dT引物统一从mRNA的ployA尾巴开始逆转录。这种逆转录引物在扩增cDNA全长时是必须的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用Oligo dT引物进行逆转录。
但miRNA与mRNA不同，成熟的miRNA的长度只有20nt左右，非常短，通常正向引物就足以覆盖其全长甚至有余，反向引物就无处安放了。那么如何实现miRNA的qPCR扩增呢？解决方案就是在逆转录的时候设法增加逆转录产物长度。普遍的方法有两种，加尾法和茎环法。经过加尾法或茎环法这种特殊的逆转录形式处理之后，得到的cDNA长度从原始的20nt增加到80nt以上，这样就能够实现miRNA的qPCR扩增了。
 
miRNA加尾法逆转录

原理
增加miRNA逆转录产物长度最直接的方法就是增加miRNA的长度，即在miRNA的3端后面添加一段序列，然后进行逆转录反应。因此，加尾法是由两个酶共同作用完成的，它们分别是PolyA聚合酶和逆转录酶。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。其过程如下：

加尾法逆转录引物的结构并不是想象中那么简单的oligo dT，
其包含三个关键结构：
①为了与PolyA序列互补配对，Oligo dT序列必不可少。
② 在Oligo dT序列的5端，存在一段通用序列，用于qPCR过程中反向引物与cDNA的结合。
③ Oligo dT序列的3端存在一个或两个锚定碱基，V或者VN。(兼并碱基，V代表A、G或C，N代表ATCG中的任意一种)。

如果没有锚定碱基，逆转录引物中的Oligo dT就会随机结合到PolyA的任意位置，这样会造成同一miRNA的逆转录产物长度不一，给最后的熔解曲线检测带来麻烦。因此，锚定碱基的作用就是特异性地结合到miRNA上，从而让逆转录引物结合到紧挨着miRNA的那段PolyA序列上。
只有这样，才能够保证同一miRNA的逆转录产物大小相同。
qPCR
miRNA荧光定量PCR的过程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆转录产物的5端均为通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根据miRNA序列设计的正向引物。正向引物的特异性就变得非常重要。对于内参，生工生物的miRNA加尾法第一链cDNA合成试剂盒(B532451)中内置了内参U6的正向引物，使用该引物与通用引物R即可进行内参U6的扩增。 
加尾法的特点
加尾法逆转录的最大特点在于：对于抽提纯化的miRNA，进行无差别加尾。因此，如果用户需要对样本中的多个miRNA进行考察，一次逆转录即可完成对所有qPCR模板的制备。qPCR引物方面，miRNA以及内参的反向引物都是通用引物R，不同的只是正向引物。因此在设计加尾法miRNA的qPCR引物时，只需设计特异性正向引物即可，正向引物的特异性直接决定了实验结果的好坏。总之，加尾法适合对样本中多个miRNA的快速检测。引物设计简单，但有非特异性的风险。由于其特殊的加PolyA机制，因此miRNA加尾法逆转录是无法仅通过常规的mRNA逆转录试剂盒完成的。