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《Nature Neuroscience》一篇单细胞测序文章解析

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                 《Nature Neuroscience》一篇单细胞测序文章解析

以下文章来源于单细胞视界 ,作者夏末 单细胞视界
带你领略单细胞的奥秘,探索单细胞的世界


关于单细胞测序(Single cell sequencing,ScRNA-seq),相信大家或多或少都听过,粗略的说,这几点是出现频率比较高的关键词:“很火”、“高端,是发大文章的利器”、“价格贵”。不过,大家如果留意最近单细胞测序相关的文章进展,就会发现这样的一个问题:现在只做单细胞测序,已经越来越难发高分(IF 10+)的期刊了。据我们不完全统计,基本上每个常见疾病国内都至少有3个以上的团队在开展研究,甚至文章已经在审稿状态了。以肿瘤为例,几乎所有的大癌种(肝癌、肺癌、肠癌、乳腺癌等等)已经有至少一篇主刊或者大子刊发表了。当然,研究一个疾病的角度可以有很多,即使是相同的实验设计,也可以有不同的发现,而这些发现也需要进一步的验证。换句话说,在不拼样本量的情况下(对科研经费的消耗实在太大了),单细胞测序技术早已经进入另一个阶段:在单细胞测序的基础上展开严谨深入的后续实验对发现进行验证。

在这一阶段,有个至关重要的实际问题:如何结合科学问题从浩如烟海的单细胞测序数据中抽丝剥茧找到关键发现?实际上,高通量测序技术的发展一方面为生物学家提供了新的工具,另一方面也提出了新的挑战:如何对高通量测序数据进行课题个性化的解读、挖掘和判断。一般来说,科研服务公司的测序报告是流程化且固定的,而每个课题所研究的科学问题则是不同的,那么这种矛盾是如何解决的呢?对于课题组来说,可以招生物信息学专业的博后来解决;另外一种常见的做法是向科研服务公司提交个性化分析;最后一种是与生信课题组合作。三个解决办法中,第一种是最理想,门槛也是最高的,不是所有人都有条件招专业的生信博后;第二种是门槛最低的,问题是时间(排队?)、效率以及最重要的思路,从某种意义上说,个性化是科研的核心,也是公司盈利的大坑;第三种的特点很清晰:蛋糕如何分配。
 
举个简单的例子:如果你对某个临床问题(如A疾病的发生)感兴趣,现在你已经拿到了单疾病组和对照组样本的单细胞测序结果,可能需要解决的基本问题有:

 单细胞测序的质量如何?

 对于具体的研究来说,分析成多少cluster是合适的?

如何将cluster鉴定到细胞类型(celltype)?

 某一细胞类型(cell type)的不同cluster关系是怎样的?

 如何确定与科学问题相关的细胞类型及cluster?

 如何将相关的细胞类型及cluster的功能特性与科学问题联系起来?

 如何设计下游实验对科学问题相关的细胞类型及cluster进行验证?

等等。
 
下面我们以一篇发表在Nature Neuroscience期刊上的一篇文章(brief communication)为例,看一下上述问题是如何解决的。
 

 

文章的研究主题很清楚:阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)AD和衰老过程中疾病相关的星形胶质细胞(Astrocytes)。简单易懂:这篇文章鉴定到了一类与AD和衰老相关的星胶,这也符合Brief communication类型文章的特点。
 
文章通过单细胞核RNA测序(Single-nucleus RNA sequencing,snRNA seq)技术对7月龄的野生型(WT)和5xFAD模型小鼠(各4只)进行检测,共测到54769个(高质量)细胞核,Seurat聚类得到23个cluster:

 

注意:野生型(WT)和5xFAD模型小鼠两组细胞cluster相似,说明已去除批次效应等因素的影响。
 
接下来,对两组所有cluster的细胞比例进行统计分析,发现6个cluster(1:Astrocytes,3:Ependymal,4:Endothelial,5:Fibroblasts,11:Microglia和23:ExN.IEGs)的比例在两组间有显著差异。其中Cluster 1星胶在AD组中的比例显著高于WT组,因此后续的研究就围绕星胶(Astrocytes)与AD的关系展开。
 
然后,研究团队对星胶(Astrocytes)的两个类群(包括cluster 1和2,共7345个细胞)进行重新再聚类,共得到6个星胶亚群。进一步根据Gfap(星胶的marker基因)的表达水平可以重新分成Gfap-低表达(Gfap-low:cluster 1,2)和Gfap-高表达(Gfap-high:cluster 3,4,5,6)两类:

 

值得注意的是:在Gfap-高表达的星胶中,亚群4只在AD中存在,因此文章将其定义为DAAs(disease-associated astrocytes)*,而cluster 3和5被认为是分别向DAAs(cluster 4)和Gfap-high(cluster 6)过渡的中间状态。
 
*注:2017年Cell期刊报道了disease-associated microglia(DAM)与AD的关系[1],本文则参考类似的方式关注disease-associated astrocytes(DAA)。
 
至此,第一个主题就明确了:明确了与AD相关的一群星胶细胞:disease-associated astrocytes(DAAs):高表达GFAP的cluster 4。

下一个主题是:DAAs在AD中是如何发挥作用的?
 
首先看DAAs及Gfap高表达的星胶细胞中差异表达的基因和功能,结果发现:这些差异基因共同参与发育和分化,代谢通路,炎症相关信号通路:

 

其中DAAs上调的基因中包含Serpina3n(serine protease inhibitor,丝氨酸蛋白酶抑制剂,Serpina3n与淀粉样蛋白的沉积有关),Ctsb (CathepsinB,编码溶酶体半胱氨酸蛋白酶,参与淀粉样蛋白前体的蛋白水解过程)。 DAAs (cluster 4和3)同样表达Apoe,Clu以及其他与参与淀粉样蛋白酶代谢和清除过程的基因:

 

另外,DAA的239个特征基因中,有18个也是DAM(disease-associatedmicroglia)的特征基因,包括AD风险基因Apoe,Ctsb,Ctsd和Ctsl,说明在疾病状态下,不同细胞类型也有共同的表达特征:

 

最后,通过免疫荧光验证发现DAA的marker基因(Serpina3n)只在AD小鼠中检测到,和单细胞测序分析结果一致:

 

下面说第三个问题:单细胞测序分析提示DAAs可能是Gfap-low的星胶细胞分化而来,在小鼠衰老过程中情况是怎样的?
 
为了寻找疾病发展过程中如何产生这种变化,文章对不同年龄段的28只小鼠进行单核RNA测序:

 

在AD组中,4个月以后的小鼠即出现了DAAs,说明DAAs在AD早期发病过程有可能发挥作用。从拟时等分析中,文章发现Gfap-high以及DAAs类群均来源于Gfap-low类群:

 

同时,不同类群转化显著相关的基因与DAAs差异基因高度一致,这些基因是抑制或促进转化的关键基因:

 

最后在正常小鼠(13个月以后)以及年长的人类正常脑组织组也发现了DAAs,说明在正常的衰老过程中也会产生DAAs:

 

这样文章主要的三个figure的内容就介绍完了。由于受到nature neuroscience的brief communication文章类型的限制,大量的结果以附图形式从不同角度验证以上的结论,但图的形式基本类似。
 
总结一下:这篇文章主要研究了阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease)AD疾病中星胶这类细胞亚群的变化,发现了一类疾病相关的星胶(DAAs),DAAs在AD发病早期即出现并随着疾病发展而升高;同时研究还发现DAAs也出现在正常的老龄小鼠以及衰老的人类大脑中,说明这类DAAs可能与基因型以及年龄等因素有关联。

 

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