Pura修复GGGGCC六核苷酸重复扩增非编码RNA介导的神经细胞毒性

【关键词】Pura；GGGGCC重复扩增序列；ALS/FTD；神经毒性

Pura repaired expanded hexa nucleotide GGGGCC repeat non-coding RNA-caused neuronal toxicity

Master Candidate: Zhang Yu

Tutor: Associated Professor Li HongLian

Division of Histology & Embryology,Department of Anatomy

Tongji Medical College,Huazhong University of Science &Technology

Wuhan 430030.Hubei,China PR

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis(ALS) and frontotemporal dementia(FTD)are both neurodegenerative diseases.They are in progressive development ultimately tobe paralysis or death. They both share with same clinicalgenetic and pathological features. There are a lot of expanded hexanucleotide GGGGCCrepeat in ALS/FTD patients with chromosome 9 open reading frame 72(C9ORF72).Expanded hexanucleotide GGGGCC repeat in a noncoding region ofC9ORF72 is the most common cause of frontotemporal dementia(FTD) and amyotrophic lateral sclerosis  (ALS). However, the basic molecular pathogenesis remains unclear. In previous study it was found that the expanded GGGGCC repeats could inhibit downstream gene transcription and have been shown to cause neurodegeneration.The aim of this study is to further investigate the effect ofGGGGCC hexamucleotide repeat amplification

on neuronal injury and the possible mechanism.We built pEGFP-N1(wild type

plasmid),pEGFP-(GGGGCC)3 (3 repeat ofGGGGCC) and mutation plasmid pEGFP-(GGGGCC)30(30 repeat of GGGGC).Then the three plasmids were transfected into mouse neuroblastoma cell line (N2a)the cell were cultured for 48h and determined by MTT experiment. Results showed that the cell activity ofpEGFP-(GGGGCC)3o was the lowest, and the other two groups had no significant difference. Quantitative analysis of the number and length of cell neurites by immunofluorescence staining growth-related protein(microtubule associated protein 2,MAP2) showed that pEGFP-(GGGGCC)3 transfected cells had the shortest neurites and the number of neurites were the least and there was no significant difference between pEGFP-(GGGGCC)3 transfection group and pEGFP-NI transfection group. The expression of total cell cyclin-dependent kinase5(CDK5)and MAP2 in the three groups was not changed by immunoblotting, while the activity of CDK5(Phospho-Tyr15-CDK5) in the mutant group was significantly increasedand the MAP2 Phosphorylation(Phospho-Ser136-MAP2)levels also increased significantly. It indicated that mutant group pEGFP-(GGGGCC)3 cells might phosphorylate MAP2 by activating CDK5,leading to cytotoxicity.It is the amount of nucleotide sequence repeat amplification mediated neurodegeneration byenriched RNA binding proteins (RBPs), and the main component of RBPs is enriched purine-rich single-stranded DNA binding protein alpha(purine-rich single-stranded DNA-binding protein alpha, Pura)and affects the normal function of Pura.To explore whether Pura have effect on neurodegeneration which were mediated by r(GGGGCC)n, We overexpressed Pura in N2a cells and compared the changes of cell viability, neurite outgrowth and MAP2 protein content and activity in the control EV+pEGFP-N1,EV+pEGFP-(GGGGCC)3，Pura+ pEGFP-(GGGGCC)3 groups [There was no significant difference in pEGFP-(GGGGCC)3 group andpEGFP-N1 group in a series of experimental studies. So the follow-up study removed the pEGFP-(GGGGCC)3 group].Results showed that overexpression of Pura couldsignificantly increase the activity of pEGFP-(GGGGCC)30 group inhibition of CDK5 activity, and reduce the phosphorylation of MAP2(Ser136) increasing.Indicating that overexpression of Pura can repair GGGGCC hexanucleotide repeat sequences mediated toxicity. Taken together our study showed that GGGGCC hexa nucleotiderepeat sequences probably leads to cytotoxicity by increasing the activity of CDK5 to phosphorylate MAP2, and this toxicity could be repaired by Pur, Which laid a theoretical foundation for the further study ofthe treatment of the two diseases.

Keywords: Pura；GGGGCCrepeat；ALS/FTD；neurotoxicity

前言

肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)是两种致命的且呈年龄依赖的神经退行性疾病[1]。ALS 患者运动皮质，脑干，和脊髓的运动神经元发生退化，导致运动障碍，肌肉功能减弱，最后瘫痪[2]。这些运动神经元的损伤呈渐进性发展，ALS 患者通常在确诊的 3-5 年内死亡[3]。ALS 最常见的病因是成年人运动神经元功能障碍，每年10万人中约有6人患病。临床上90%的ALS为散发，仅有 10%是家族性 ALS，且发生遗传继承。FTD 患者大脑额叶和前颞叶皮质神经元发生退化，是一种进行性痴呆。FTD 患者会出现行为和/或性格的改变，语言障碍，还伴有认知障碍和记忆减退。在之前的研究中ALS和FTD一直被认为是两种不相关的疾病，但是研究人员逐渐发现，在ALS患者中约有一半的人存在行为改变和认知障碍，这种表现与 FTD 极其相似[2]。在过去的十年里已经有坚实的证据证实这两种疾病存在共同的分子机制，很多基因的突变能导致

这两种疾病。也有很多ALS和FTD患者存在相似的病理特征[4.5]。ALS和FTD有相似的遗传特性。约有10%的ALS患者和40%的FTD患者都是以家族的形式发病。其神经退行性变是由一组异质基因的突变产生的[5.6]。重复扩增突变如今引起散发型病例的原因还不是很清楚，但是大多数的患者都存在神经病理损伤:RNA结合蛋白-转录激活反应DNA结合蛋白43(TDP-43)是泛素阳性包涵体中的主要成分，儿平存在干所有ALS患者(~97%)和FTD-TDP表型的用者中(~45%)[478]。随后研究发现编码TDP-43的转录激活反应DNA结合蛋白基因(TARDBP)的突变存在于接近4%的家族性ALS患者[69-11和少量的FTD病例中[12]。说明TDP-43在ALS/FTD中扮演者重要角色。除了TDP-43，其他RNA

结合蛋白也能影响这两种疾病。比如说肉瘤融合(FUS)突变也发现在约5%的ALS患者和少量的FTD病例中[6,13,14]。在约10%的FTD患者中发现有野生型FUS蛋白集聚[15]。然而患者在9号染色体开放阅读框72基因中携带六核苷酸重复序列是导致ALS-FTD最主要的遗传病因[16，17]，患者同时也有RNA聚集，它能鳌合大量的RNA结合蛋白[18-21]。此外，这些患者还有二肽重复蛋白也干扰RNA的新陈代谢[22]和TDP-43病理[23]去十年的这些突破给ALS/FTD领域提供了新的研究思路。人们不再认为ALS/FTD仅仅是蛋白折叠不足导致的蛋白病理，更多的是认为RNA结合蛋白的错误调节和受调节的RNAs代谢功能发生紊乱[24]。GGGGCC六核苷酸重复序列扩增非编码RNA(r(GGGGCC)n)可以富集RNA结合蛋白，而Pura是一种序列特异性单链DNA和RNA结合蛋白[25]。在整个进化过程中高度保守。Pura在细胞的很多生理过程中都发挥着重要作用，包括转录调节，细胞增殖和致癌转化[26]。前期研究已在体内外实验中分离并鉴定了富集RNA结合蛋白的主要成分是嘌呤丰富单链DNA结合蛋白alpha(Pura)[27]根据以上依据提出假说，RNA结合蛋白Pura在r(GGGGCC)n介导神经细胞毒性中起到重要作用。为了验证这一假说将前期构建的pEGFP-(GGGGCC)3和pEGFP-(GGGGCC)3o两种质粒，转染到小鼠成神经瘤细胞株(N2a)细胞模型中，测定GGGGCC重复扩增突变对神经细胞活性、发育和对神经发育相关蛋白的影响;研究过表达 Pura对GGGGCC重复扩增序列导致的神经细胞毒性及对神经发育相关蛋白的影响。

材料和方法

1.常用试剂

0.01mol/L PBS缓冲液，TBS缓冲液，异丙醇，甲醇，柠檬酸钠修复液，4%多聚甲醛，10%TritonX100，5%BSA，30%H2O2，25%、30%蔗糖溶液，10XDAB1mol/L Tri-Hel,Running Buffer,Transfer Buffer30%Arc/Bic，10%APS，细胞裂解液(PH7.4)PMSF,Cocktail(Sigma)LB培养基及LB平板，DMEM(Gibco) Opti-MEM(Gibco)，FBS(Gibco)，0.25%胰蛋白酶消化液，Trizol，蛋白酶抑制剂，Lipofactamine2000(Invitrogen)，异丙醇，琼脂糖(BIOSHARP)，新型高效 DH5a 感受态细胞，SOC 培养基，高纯度大提试剂盒(康维世纪)，Mounting Medium with DAPI(中杉金桥)，0.45um的NC膜(Millipore)，Marker Ladder  (Fermentas),PierceM BCA Protein Assay Kit(Thermo Scientific)等。本研究所用的抗体见表1。

综 述

ALS是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部(所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉)、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩，是渐进的致命的运动神经元紊乱，由点向面扩散。它能导致四肢、呼吸和延髓肌肉功能减弱，同时咀嚼、吞咽、说话的能力也逐渐丧失。ALS 定义为“孤儿病”每年约十万分之二发病率和十万分之五的患病率[1。在美国[2]和欧洲[3], ALS的死亡率为1500到1\1000，暗示美国将有50万人最终死于此疾病。大约有10%的ALS 是遗传性的，通常带有显性遗传的特征[4.5]。家族性的ALS(fALS)和散发的ALS(sALS)均能同时伴有额濒叶痴呆。AD引起的痴呆主要是记忆的丢失，额颞叶痴呆则是行为改变和渐进性失语症，有时伴有运动功能失调[6.7]。且AD的主要病理改变在海马，额颞叶痴呆主要是额颞叶早期萎缩。病理学上，ALS和FTD的特征在于在受影响的脑和脊髓区域中的胞质蛋白包涵体。在绝大多数ALS病例中，这些泛素阳性包涵体的主要组分是TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)[8]另外是具有融合在肉瘤(FUS)和超氧化物歧化酶1(SOD1)中的突变的患者，其中FUS或SOD1蛋白分别聚集[9。FTD还经常以TDP-43胞质聚集体为特征这可以在约50%的FTD患者中发现[10]。FUS聚集体存在于10%的FTD病例中 [11]。在约40%的 FTD 病例中，Tau 是病理性内含物的主要成分(12]。在人染色体9开放阅读框72(C9ORF72)基因的非编码区中鉴定了肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞痴呆(FTD)的最常见的遗传原因是六核苷酸重复扩增(HRE)GGGGCC(G4C2>30)，并且这种扩增也存在于其他神经退行性疾病中，这是该领域中最近20年的研究中的主要突破之一[13.14]。 事实上， C9ORF72基因中的G4C2HRE在多达40%的fALS和FTD以及在约9%的sALS病例中被检测到，在其他神经变性疾病中有进一步的描述(13-16]。sALS,fALS 或者是来自于不同的遗传学基因的ALS-FTD 患者的尸检报告病理学分析得出4个常见的原因。首先，运动神经元死亡均伴有聚集蛋白质的沉积。主要是细胞浆蛋白质和泛素化。其次，在ALS中RNA和RNA结合蛋白的功能与水平是异常的。在运动神经元和非运动神经元细胞(比如星型胶质细胞和小神经胶质细胞)中均能检测到RNA和蛋白质的聚集。再者，绝大多数患者神经元细胞骨架蛋白的结构和功能都有紊乱。最后，几乎所有患者的运动神经元死亡都受到像少突胶质细胞和一些神经炎症细胞(比如星型胶质细胞和小胶质细胞)等非神经元细胞的影响。

2蛋白质毒性:蛋白质集聚

关于ALS发病机理有一个重要的观点是它与一些蛋白质功能紊乱有关，不管蛋白质是野生型还是突变型，在fALS和sALS都存在功能紊乱。人们通过聚集物的形成，异常的剪接或翻译后修饰(如泛素化或高度磷酸化)证实了这一观点。这些改变是受影响蛋白质突变的主要结果，也是疾病进展的过程。蛋白质集聚和包涵体。从早期发现运动神经元内泛素化沉积(17到现在的几十年间，蛋白质病理变化在ALS的研究中的一直占重要作用。ALS患者蛋白质构象不稳定或修饰改变，进而导致蛋白质降解。

2.1铜锌超氧化物歧化酶SOD1

铜锌超氧化物歧化酶是第一个被发现由突变导致ALS的基因[18]。铜锌超氧化物歧化酶有超过 160 个不同的错意和 12 个截断突变[19]。这些蛋白质构象的改变能引发脊髓运动神经元[20]内聚集物在体内和体外的沉积[21，22]。突变介导的构象改变的程度和临床进展的比率有一定的相关性[22]。突变的SOD1也自发的在体内和体外形成低聚物[23,24]。这些低聚物是亚显微结构而且大多数时候都可溶[25]。可能比那些大的，可见的集聚物更具有毒性[26,27]。突变体SODI毒性的分子机制是多因素且复杂的。因为 SOD1可以给有氧代谢的副产物-超氧阴离子解毒，这很可能是突变体 SOD1引起氧化应激。当SOD1中锌是耗尽的情况下，这一应激反应会被夸大，加速错误折叠[28]。其次，突变的SODI可以形成有毒的硝基酪氨酸[29]。第三个因素，SOD1 是异常的细胞缓冲和铜锌运输。第四方面是不稳定突变体SOD1蛋白获得结合具有疏水表面的物质的能力，其中，WT SOD较少粘附[30]。无论是SOD1毒性的分子基础还是错误折叠都可以引起广泛的中胞功能紊乱。

2.2转录激活反应DNA结合蛋白-43(TDP-43)

早期ALS的病理学特征是泛素化蛋白的累积[31。主要的突破性研究是 2006年Neumann及其同事发现的反式作用元件DNA结合蛋白(TDP-43)是SALS和FTLD泛素化靶点8。TDP-43基因(TARDBP)编码分子量为43 的蛋白，它包含2个RNA识别区域一个是甘氨酸富集区域，一个是假定的朊病毒样结构域。它俩都与核定位与核输出有关。在正常情况下，TDP-43 位于细胞核中它参与DNA/RNA结合，转录，RNA剪接，miRNA生物发生，RNA转运和RNA转录稳定[32]TDP-43 在无意义链介导的衰变中起关键作用，这个过程是由异常的mRNA转录产物(例如，被取代或缩短的碱基对)快速降解。在大多数的sALS.fALS和FTLD的案例或者过度磷酸化中，剪切的TDP-43在神经元的细胞质和胶质细胞中广泛累积，并组装成圆形和线状包含物。TDP-43的这些病理形式首先出现在脊髓运动神经元，随后通过中枢神经系统运输到整个大脑[33]。现在TDP-43 被认为是不同神经退行性病中细胞质沉积的一个组件。在这些沉积中TDP-43从细胞核中耗尽暗示TDP-43介导的毒性可能是其在核内功能的丧失或是在细胞质呈现相反的病理表现亦或二者都有。

23肉瘤融合(FUS)在鉴定TDP-43后不久，通过分析佛得角fALS家谱[934]，发现了第二个RNA结合蛋白，它融合于肉瘤/易位于脂肪肉瘤(FUS/TLS或只是FUS)。与TDP-43

的结构相比，FUS 定位于细胞核内，且与DNA和RNA有着广泛的相互作用。它通过RNA的加工可以移位到细胞质中。几乎一半的FUS突变是在富含甘氨酸结构域中较小决定簇的 C-末端核定位序列中。像SOD1和TDP-43 突变或者是 sALS WT TDP-43 一样，突变的FUS也存在于不同类型的细胞包涵体内。也许最值得注意的是，FUS 是应激颗粒的主要组成部分，FUS 突变能导致这种蛋白质的增加，并形成细胞质结构。FUS 突变也是fALS 和FTLD泛素化和p62 阳性细胞质包涵体的主要组成成分。这些聚集物能在大脑和脊髓的神经元和神经胶质细胞中检测到[26,27]。与TDP-43 包涵体不同的是，FUS 阳性包涵体的阳性率低[35-37]。几乎不存在FUS 依赖的 ALS 小鼠模型。没有 FUS 基因的小鼠可以生存但是不能生育，且染色体也不稳定[38]。表达FUS 突变体的转基因大鼠可以发展为是不能生育，且染色体也不稳定。表达FUS突变体的转基因大展可以发展为活动性运动神经元疾病[39]。

2.4 C9ORF7基因突变

2011 年，有三个团队发现，40%-50%的 fALS 和8%-10%的 SALS 以及 ALS-FTLD 的患者是由 C9ORF7 基因突变引起的[13，40,41]。该基因编码大约54.3KDa的蛋白质(481个氨基酸)，其功能仍然未知。生物信息学分析表明这种蛋白质具有共同的结构特征，它在正常和肿瘤细胞(DENN)和GDP/GTP交换因子(GEF)中有不同的表达。还可以调节细胞膜的转运[42]。这一特殊突变基因是内含子六核苷酸GGGGCC(G4C2)重复扩增序列。在C9ORF7 相关的ALS中通常存在30个或更少的重复序列，重复域包含数百个串联重复[43]。重复片段在ALS和ALS-FTLD谱系中作为显性性状传播的。受影响的个体在扩增的等位基因是杂合的，纯合子不常见[44,45]。

2.5损伤

人们从SOD1突变是ALS的起因中联想到氧化应激毒性游离的超氧化物自由基可能进入氧和过氧化氢[46]。突变体 SOD1的存在加速运动神经元对谷氨酸毒性的敏感性，引起a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异戊唑丙酸(AMPA)受体亚基表达 [47]，并逐渐导致兴奋性氨基酸转运蛋白(EAAT)的表达减少[48]。氧化损伤不仅与SOD1有关，而且在TDP-43[49]和FUS[50]中也有记载，并且氧化应激保护蛋白的使用减少了凋亡和聚集[51]。在死后组织中，通过检测蛋白质羰基，神经元一氧化氮合酶(nNOS)和脂质过氧化[52]，已证明存在氧化应激的增加，在转基因SOD1小鼠中也具有相似的结果[53]。此外，运动神经元不是唯一受氧化应激影响的细胞。携带突变蛋白质的星形胶质细胞和小胶质细胞也已显示有助于增加氧化损伤，导致运动神经元死亡[54]

2.6 谷氨酸损伤

谷氨酸是中枢神经系统(CNS)中的主要兴奋性神经递质，并且存在于运动神经元中[55]。有两种类型的谷氨酸受体:离子型和代谢型。前者可以进一步分为N甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和非NMDA受体，而后者由G-蛋白偶联

2.6 谷氨酸损伤

谷氨酸是中枢神经系统(CNS)中的主要兴奋性神经递质，并且存在于运动神经元中[55]。有两种类型的谷氨酸受体:离子型和代谢型。前者可以进一步分为N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和非NMDA受体，而后者由G-蛋白偶联受体组成[56]。在ALS的发病机理与兴奋性毒性有高度显著关系，当谷氨酸受体过度刺激时引起神经元损伤，兴奋毒性后遗症增加细胞内钙和过度的自由基产生[57]。且运动神经元通过谷氨酸激活细胞表面 AMPA 受体对易兴奋性毒性敏感[58]增加的谷氨酸水平可导致在ALS选择性神经元损伤[59]。因此，运动神经元可以表达特定类型的易感谷氨酸受体[60]。Spreux-Varoquaux等人的一项研究显示 ALS 患者的脑脊髓液(CSF)中谷氨酸水平增加。高谷氨酸浓度与 ALS 的脊柱发作，更大的受损肢体功能和更高的肌肉减弱率相关。其他论文报道了在 ALS患者的CSF和空腹血浆中谷氨酸水平异常高[61]。这种增加可能由谷氨酸再摄取

的损伤或星形胶质细胞谷氨酸再摄取转运蛋白EAAT2的表达减少引起，其在ALS患者中显着减少[62]。异常EAAT2mRNA加工最初被认为是EEAT2表达减少的原因[63]。与其他研究发现正常人和ALS患者之间的剪接变化[64]。已经证明SOD1G85R突变小鼠表达50%甚至更少的胶质谷氨酸转运蛋白-1，说明神经元支持细胞中谷氨酸代谢改变的作[65]。还观察到携带C9ORF72突变的患者诱导的多能干细胞(iPSC)更易受谷氨酸毒性的影响[66]，进一步牵连 ALS 中的谷氨酸毒性。

2.7线粒体损伤和能量代谢

线粒体功能障碍与反应性氧化物质(ROS)损伤密切相关，因为呼吸链中的

泄漏可导致氧化剂物质的释放和三磷酸腺苷(ATP)产生的改变[67]。线粒体功能

障碍也与谷氨酸相关，它可以改变能量代谢，并且可通过增加细胞色素c和内质网(ER)应激而引起凋亡[68]。在 SOD1突变小鼠中，已经发现线粒体在神经元中分布的改变，特别是在神经肌肉接头处，导致肿胀，空泡化和线粒体聚集[49]。此外，线粒体裂变基因的上调，也已经在过表达TDP-43 的小鼠中观察到[69]。在细胞培养物中，表明多种 ALS 机制错综复杂又相互联系[70]。最近对来自患者的 iPSC的基因谱进行了表现出强相关性。线粒体功能障碍，如载脂蛋白E(APOE)驱动蛋白家族成员1A(KIF1A)和dynactin1(DCTN1)[65]，表明线粒体功能障iPSC的基因谱进行了表现出强相关性。线粒体功能障碍，如载脂蛋白E(APOE)驱动蛋白家族成员1A(KIF1A)和dynactinl(DCTN1)[65]，表明线粒体功能障碍与能量代谢有关。在SOD1小鼠中超极化线粒体膜电位的改变与SOD1活性的丢失，可以通过线粒体靶向野生型(wt)SOD1的表达来拯救[70]。作为细胞的巨头，线粒体功能的改变导致能量稳态和产物的变化。在 ALS 患者中观察到脂质和碳水化合物代谢的变化，并且已经显示能量高的饮食可以增加存活率[68]。

3 RNA 生物学

31RNA/DNA结合功能。如上所述，大量的DNA/RNA相互作用蛋白现已与家族性 ALS 相关联，最常见的TDP-43和FUS与较为少见的例子，包括TAF15，EWSR1，ANG，SETXELP3和共济失调-1，-2，hnRNPA1和hnRNPA2B1和CREST。TDP-43和FUS在DNA和RNA加工的几乎每一个方面都发挥着功能，包括转录，剪接，RNA运输，miRNA进程和翻译。我们对于这些蛋白在ALS中的发病机制的认识还很局限，我们也不知道这些蛋白质的绝大部分的功能，这是我们对于fALS认知的薄弱环节。在正常生理条件下，这些fALS 相关的DNA/RNA结合蛋白主要在核内，有一部分能在生理情况下转移到细胞质。与ALS相关的不同蛋白突变体(例如，TDP-43.FUSTAF15.hnRNPA1hnRNA2B1)经常耗尽核内的蛋白异位到细胞质[8.9]。我们还不是很清楚ALS主要病理是否是核内蛋白质功能丧失或者是获得的细胞毒性效应影响这些蛋白质的正常功能。有一点我们清楚这些蛋白功能能持续被ALS相关蛋白突变体影响。例如，TDP-43和hnRNPA1识别RNA转录的剪切位点[71,72]。在过表达人0331K 突变的小鼠中，有超过1000种不同的RNA转录剪切被改变[73]。32RNA有意义链和反义链RNA转录在C9ORF7介导的ALS细胞核内聚集。通过对1型肌强制性营养不良的研究发现这些聚集物可能介导不利反应，其中CTG重复序列转录的RNA聚集物隔离转录剪切因子盲肌样-1(MBNL-1)，并消耗核内的蛋白质[74]。可能这种模式适合C9ORF7fALS患者鉴定GGGGCC重复护增序列有意义链和反义链转录聚集物。迄今鉴定候选物包括ADARB2[74]hnRNP-H，和SF2[75,76]，尽管这些聚集物结合的结果我们还不清楚。

4 细胞骨架功能

运动神经元的关键特征是它们轴突的长度，使它们高度依赖于细胞内部的传输机制以维持正常的结构和功能。维持这种非同寻常的构造的关键是细胞骨架和相关的分子支架和电动机。早期 ALS的遗传学研究发现一些罕见的突变编码神经丝重链[76-78]和外周蛋白[79-81]，这又是细胞质包含物的组份。其他细胞骨架组份已被确定为罕见的引起ALS的因素。fALSDNA外显子测序鉴定了编码抑制蛋白-1(profilin-1)的四种突变，在单体肌动蛋白(G-actin)转换成纤维肌动蛋白(F-acting)形式[82]。细胞骨架成分也充当着ALS表型的修改器。EphA4，一种调节轴突发育生长的受体酪氨酸激酶配体。通过减少突变体表达或突变体功能丢失来减弱 EphA4 活性从而加强损伤后的轴突生长。反过来也可能增强 ALS 鼠杂合子的生存率。其他疾病修饰因素如 EphA4 将增加我们对 ALS 分子机制的理解并为干预治疗提供靶点。5 轴突运输。与细胞骨架一样，高效的轴突运输对于轴突功能来说是至关重要的。ALS相关突变如今认为是轴突运输系统的组成成分。囊泡和细胞器逆向运输到运动动力蛋白需要动力蛋白激活蛋白的参与。在啮齿动物中有介绍DCTN1的突变导致功能障碍和有缺陷的囊泡运输，运动神经元的变性和过早死亡[83，84]。轴突运输的第二个组成部分，驱动蛋白相关蛋白3(KIFAP3)，被认为是sALS存活的调节器。减少 KIFAP3 表达的多态性与延长 sALS 患者的寿命有关，尽管这种相关性并没有在所有人类中看到[85]。KIFAP3与KIF3A和KIF3B形成三聚体复合物，目KIFAP3参与顺行性运输和染色体胞质分裂。KIFAP3在疾病中的作用还不法楚，然而在 SOD1转基因鼠中发现其表达增加。最后，fALS 相关突变存在于囊泡相关膜蛋白/小突触泡蛋白相关膜蛋白(VAPB)上，在高尔基和雌激素受体囊泡运输和分泌中这种广泛表达的蛋白就尤为重要[86]。分泌的 VAPB 是 Eph 受体的配体:它的分泌被 ALS 相关突变所阻断。在果蝇表达突变 VAPB可以诱导突触形态的不足和神经退行性变[87]。

6运动神经元非细胞自主性影响

从SOD1ALS转基因鼠中发现一个要点即不同于运动神经元，细胞可以改变疾病的进程。有数据显示当运动神经元被野生型细胞环绕时在运动神经元中表达突变的SOD1G93A可以显著提高小鼠的生存率。SOD1G93AALS转基因鼠通过消除星形胶质细胞，小神经胶质细胞或少突神经胶质细胞中的SODI基因从而显著提高生存率。相反的，当突变 SOD1基因从转基因鼠的雪旺细胞中大量消除时，将使转基因鼠生存率降低。运动神经元死亡进程可引起神经炎症反应，招募并激活星形胶质细胞和小胶质细胞。小胶质细胞可以起神经保护作用也可以起毒性作用，这取决于进入反应的 T 细胞的表型等许多因素。ALS 介导的星形胶质细胞对运动神经元是有毒性的，这已被人们使用人类多能干细胞诱导星形胶质细胞和运动神经元的体外实验证实[88-90]。培养的ALS星形胶质细胞介导的毒性可能涉及前列腺受体信号通路[9。

7结论

就像其他神经退行性疾病，在ALS治疗进展的道路上还有很长的路要走。尤其是我们对这种疾病的基础生物学机制的了解还严重不足。也许最重要的挑战是目前还不清楚是什么原因导致的 ALS。我们发现了一个明显的机制就是运动神经元死亡，它可能涉及毒害神经元的环境因素?遗传因素是否决定对毒素的敏感性? 为什么从最早期胚胎发育表达突变基因到fALS的发生会间隔数十年?这是否反应了有丝分裂后运动神经元损伤病变是年龄依赖性，或是为应对有毒因素而出现的运动神经元功能的去失，亦或是这些因素都存在?会不会是ALS中复杂基多种类基因或异位显性基因之间的相互作用?表观遗传因素或微生物干扰在fALS和sALS又扮演者什么样的角色? 还有一个挑战就是在ALS治疗中如何访问中枢神经系统。血脑屏障的存在使得大脑和脊髓得到保护，这就限制了很多能也适用于sALS。总的来说，这些治疗的进展以及对病理生理学的洞察使我们对于ALS有意义的治疗更为乐观，至少是遗传形式的ALS的治疗更加乐观。