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BSP/MSP具体操作步骤Protocol

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                                BSP/MSP具体操作步骤Protocol
 

一、引物设计
1. 确定目的基因后,登陆网址:UCSC Genome Bioinformatics

2. 选网页左边的:Genome Browser后,进入基因检索界面

3. 在Assembly下拉菜单选择:Mar.2006

4. 在position or search term 输入基因名称,如APC后,submit

5. 在RefSeq 里面选择你的基因,如这里较多亚型时,最好参照您的NM_000000进行选择;如没有,调最长的isoform,点击之

6. 此时进入附图画面,在左边你可以看到标记蓝底的APC基因,点击之,进入下一界面

7. 在links to the sequence里面,选择Genomic sequence

8. 点击进入后,可在Promoter/Upstream by里面根据需要填个数值,比如500

9. submit 后进入基因系列

10. 大些字母处即为转录起始处,transcription start site,TSS

11. 从头开始,选定基因序列至完全涵盖TSS,可以长点,复制

12. 打开urogene

13. 在复制框里面黏贴

14. 选择你要的引物类型,如Bisulfite Sequencing,点击submit

15. 可看到参考引物,按你感兴趣的位点选择引物即可。引物的具体信息下面会有详细介绍。

二、BSP-亚硫酸盐修饰:
BSP 主要目的是,通过测定亚硫酸盐修饰后的DNA序列,了解特定基因的具体CpG位点的甲基化情况。而MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息,BSP则可以详细了解每一个CpG位点的甲基化情况。

1. 首先,按前帖设计引物后,确定BSP反应条件。一般做45个cycle。通常BSP的退火温度会比相应的MSP的退货温度低。

2. BSPCR后,取10ul跑PCR,如条带单一,则直接克隆,具体操作按照Invitrogen的TOPO试剂盒进行:如条带有杂带,需要进行PCR Screen,具体操作及原理不再赘述;

3. 克隆后在L+Amp平皿上,培养过夜后,后通常取8-12个克隆,液体LB+Amp培养过夜;

4. 过夜后LB液浑浊;按照Mini Plasmid DNA提取试剂盒操作说明,提取质粒DNA;

5. 半量反应后,送叫测序;

6. 测序结果报告用Chromas软件打开(或者FinchTV软件阅读,可用GOOGLE搜索后在线注册下载安装),寻找出目的片段后,建立每一个克隆序列的TEXT文本(后续的BiQ Analyzer用这个文件导入)。

7. 将上述文件导入BiQ Analyzer后,按研究需要质控,最后生成BSP直观图。

 

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