基因与蛋白质实验研究的瑞士军刀

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protein G beads

protein-G/A只能和IgG结合，不会和His标签结合

【产品介绍】 Protein G Beads是将重组Protein G蛋白分子共价交联到4%琼脂糖胶粒上制成。本产品使用特殊试剂对琼脂糖胶粒表面进行了处理，降低了Beads对杂蛋白的非特异性吸附；并使用了多点偶联技术，提高了产品的稳定性。Beads 分散在含有0.01%叠氮化钠的PBS缓冲液中，用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究。2 ml包装内含有0.5 ml Beads，可进行100次常规的免疫沉淀试验。

【使用说明】

A. 样品的制备： 1. 对于100 mm培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，使用预冷PBS洗涤一次后加入2毫升细胞裂解液裂解细胞。对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。植物或动物组织样品可以使用液氮研磨方法裂解。具体的裂解方法请参考不同裂解液的使用说明，裂解液最终总蛋白浓度选择在0.5-1μg/μl范围内较为合适。通常针对目标蛋白的表达量不同，需要对总蛋白浓度进行预实验调整。

B. 去除非特异性结合（可省略）： 2. 取200微升至1毫升蛋白样品，加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的 Normal IgG和20微升充分重悬的Protein G，4℃缓慢摇动30分钟。

3. 2500 rpm (约1000 g)离心1分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。注：哺乳动物细胞内有多种成分可以和IgG发生结合，可能会在后续免疫印迹中出现非特异性条带。使用normal IgG和Protein G Beads对裂解液预处理可以降低非特异性吸附。 C. 免疫沉淀：

4. 在蛋白裂解液中加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动1-2小时。

5. 加入20微升充分重悬的Protein G，4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把Beads的量调整为40微升，如果实验时间不充裕，Beads和抗体的结合时间可以减至0.5小时。)

6. 2500 rpm (约1000g) 离心1分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Beads。

7. 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀后的Beads，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升，洗涤时离心条件和吸除上清的要求同步骤6，重复洗涤步骤3次。

8. 完成最后一次洗涤后，使用上样针充分去除上清，再加入20-40微升1XSDS-PAGE 电泳上样缓冲液，Vortex振荡混合均匀，瞬时高速离心将样品集中于管底。

9. 100℃水浴煮样3-5分钟，取样品用于SDS-PAGE电泳，转膜后进行Western分析

Ni-NTA bead

Ni-NTA Purification System For purification of polyhistidine-containing recombinant proteins

Talon Metal Affinity Resin TALON金属亲和树脂

TALON is an immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin for the purification of histidine tagged (his-tagged) proteins.

Only adjacent or specially positioned, neighboring histidines are able to bind to the TALON cobalt ligand core. Thus, TALON binds his-tagged proteins with higher selectivity than nickel-based resins like Ni-NTA.

This offers two advantages. First, less background proteins bind to TALON Resin, so cumbersome washing procedures are generally not required before protein elution. Second, his-tagged proteins elute from TALON Resin under mild, physiological conditions, which can be crucial to keep the protein biologically active.

TALON resins exhibit less metal ion leakage than Ni-NTA resins because cobalt forms more uniform complexes with the chelating ligand than nickel. This means that no bound proteins are lost by metal leakage and that virtually no metal ions will co-elute with the purified protein.

Transduction into mammalian cells Lipofectamine 2000

Invitrogen 阳离子转染试剂 Lipofectamine 2000 细胞转染实验步骤注意事项 2010-07-10 16:16 Invitrogen 的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000 是最为人熟知的转染产品之一。已知可为 517 种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。特点两个关键性特点使得 Lipofectamine 2000 试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去 Lipofectamine 2000 试剂，无需换培养基操作流程事实上 Lipofectamine 系列产品操作流程都是又快又简单：稀释 DNA 以及 Lipofectamine 2000，混合 2 种稀释液保温 20 分钟，加入培养细胞中孵育 24－96 小时检测结果。下面是 Invitrogen 提供的详细流程和注意事项。

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为 90%。细胞铺板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

1. 对于每孔细胞，使用 50μ l 无血清培养基（如 OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 0.8μ g-1.0μ g DNA。

2.对于每孔细胞，使用 50μ l OPTI-MEMⅠ培养基稀释 1μ l-3μ l LIPOFECTAMINE 2000 试剂。

3.Lipofectamine 2000 稀释后保温 5 分钟（在 30 分钟内同稀释的 DNA 混合。保温时间过长会降低活性。）注意：即使 Lipofectamine 2000 使用 OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用 D-MEM 培养。如果 D-MEM 做为 Lipofectamine 2000 的稀释液，必须在 5 分钟内同稀释的 DNA 混合。混合稀释的 DNA（第 2 步）和稀释的 Lipofectamine 2000（第 3 步）。

4.在室温保温 20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持 6 小时稳定。

5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为 0.5ml 无血清培养基。在 37℃， 5％的 CO2 中保温 24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在 4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

瞬时表达在细胞中加入复合物 24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。

对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

基因克隆工具酶 FunGenome Golden Taq

PCR克隆金牌Taq酶-高保真高效扩增的 FG

耐高温DNA聚合酶的选择对于实验目的、实验的准确性、稳定性等均是成败攸关。从扩增的速率和忠实性来考虑, 耐高温DNA聚合酶可分为三类：

第一类：扩增效率高,但没有校正功能。该类聚合酶具有很强的从5’→3’方向合成DNA功能，但没有从3’→5’方向外切酶的活性。该类酶的合成效率高，但合成过程中出现的错误不能被有效纠正，我们的实验数据表明，在80%的克隆中，每一个kb会产生1～2突变。该类酶的代表就是普通Taq 酶（Taq DNA Polymerase），它扩增效率高，广泛应用于DNA片段大小的鉴定和菌落克隆鉴定，由于该酶尚能在合成的DNA的3’端羟基上加A，故而还用于PCR产物的T载体克隆。因该类酶不具有纠错功能，因而其扩增产物不宜用于基因突变检测和以基因表达及功能研究为目的之基因克隆。市售的所谓Platinum Taq 据称有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但笔者在美国做博士后研究期间用它来做批量克隆，测序结果发现其突变频率与普通Taq酶没有多少差别，对其印象深刻，因而它应被归类为普通Taq酶类。

第二类：既具有5’→3’方向合成DNA的功能，又具有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但DNA合成效率与普通Taq 酶相比大大降低。Pfu DNA 聚合酶便是这一类酶的代表，据称，Pfu的保真度在所有耐热DNA聚合酶中是最高的。我们以Pfu作为批量克隆中的工具酶，测序结果表明，0.8～1.5kb 的扩增片段，50%的克隆发现有突变；而1.8kb以上的扩增片段克隆中，突变的发生几乎无一幸免。

第三类：高保真高效率DNA聚合酶，兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq 酶与Pfu DNA 聚合酶按一定比例混合即可（如Taq Plus），并为很多公司和客户所采用，但混合后由于二者对底物模板存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果，于是，用基因工程的方法获得理想的第三类酶便成为PCR领域的一块研发高地。泛基诺科研人员，依其长期从事分子生物学基础研究之积淀，利用丙氨酸扫描技术鉴定出聚合酶和外切酶活性的最小结构域和相关的活性位点，进而用遗传学和基因工程方法获得既能高效扩增又具有很强的校正功能的金牌Taq （FG Golden Taq DNA Polymerase），稳定性高于普通 Taq酶，纠错功能强于Pfu

细胞凋亡研究

细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。以标记了FITC的AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。Propidium iodide（PI）是一种核酸染料(nucleic acid dyes)，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。将AnnexinⅤ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
Annexin V–FITC is used to quantitatively determine the percentage of cells undergoing apoptosis. It relies on the property of cells to lose membrane asymmetry in the early phases of apoptosis. In apoptotic cells, the membrane phospholipid phosphatidylserine (PS磷脂酰丝氨酸) is translocated from the inner leaflet(叶状器官) of the plasma membrane to the outer leaflet, thereby exposing PS to the external environment.
Annexin V is a Ca2+-dependent phospholipid-binding protein that has a high affinity for PS, and is useful for identifying apoptotic cells with exposed PS. Propidium iodide (PI碘化丙啶) is a standard flow cytometric viability probe and is used to distinguish viable from nonviable cells. Viable cells with intact membranes exclude PI, whereas as the membranes of dead and damaged cells are permeable to PI. Cells that stain positive for Annexin V–FITC and negative for Propidium Iodide (PI) are undergoing apoptosis. Cells that stain positive for both Annexin V–FITC and PI are either in the end stage of apoptosis, undergoing necrosis, or are already dead.Cells that stain negative for both Annexin V–FITC and PI are alive and not undergoing measurable apoptosis.

The measurement of DNA synthesis is to label cell with BrdU, tagging it with a fluorescently labeled antibody and then using FACS (fluorescence-activated cell sorting) to examine single cell by flow cytometry

细胞增殖研究

BrdU 5-Bromo-2-deoxyUridine 5-溴脱氧尿嘧啶核苷

可代替胸腺嘧啶T在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu单克隆抗体，ICC染色( 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC组织/ Immunocytochemistry, ICC细胞)，显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

Thymidine analogues can replace the thymine on cell proliferation period into DNA molecules being copied. BrdU and EdU are this kind of substitution.

EdU是另外一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检测染料只有BrdU抗体大小的1/500，，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。而BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合，破坏了DNA双链结构，影响了Hochest等染色，导致染色弥散，准确性降低等问题，逐渐被EdU取代。