转录因子万花丛中的夏日玫瑰：酵母单杂交系统

三十年前，从德国电影《英俊少年》中认识了音乐《夏日里最后的玫瑰》，沉湎在幻想中，陶醉在音符里。从此，这首古老的爱尔兰音乐不知不觉成为工作和生活中自然和必须的休憩驿站。特别是意大利名贵大提琴的演奏更仿佛拉出了浓郁的玫瑰芬芳，在空中久久弥留，余音绕梁，令人回味。

正是在这一年，我入道江湖，开始从事生命科学研究，第一站便选择了酵母遗传学。泛基诺技术部陈博有一句发人深省的话：一个向深度发展的生命科学与医学研究实验室尤其是分子生物学实验室，正象离不开大肠杆菌的操作一样,离不开酵母的实验操作。

神奇的酵母遗传学与高等生物基因功能研究系列讲座已出三个系列，这个应该算是系列之四，但题目是：夏日玫瑰：转录因子克隆与鉴定－酵母单杂交系统

转录因子的研究方法有很多，其中比较经典的方法有以下几种：

1、凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）

该方法的原理是基于DNA在凝胶中的迁移率与其分子量的大小和构象有关。这一技术的设计思想和关键步骤主要有以下几个方面：分离细胞核蛋白或纯化转录因子、DNA探针合成与标记（同位素标记或地高辛标记）、EMSA结合反应、探针冷竞争反应、突变探针的冷竞争反应、阴性对照反应、4％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶干燥与放射自显影图像分析。这种实质上属于体外的物理结合的方法往往由于许多不同的转录因子有着相同或相似的ＤＮＡ 结合位点，加之转录过程涉及体内多种因素综合调控，这种体外分析获得的结果通常不能真实地反应体内转录因子与ＤＮＡ结合的状况，因此目前已不再将其作为主要方法来使用，而只是作为一种佐证实验。

2、足纹法（footprinting）

足纹法原理是ＤＮＡ与蛋白质结合后，被蛋白质结合的ＤＮＡ区域由于转录因子的保护，使其免受DnaseI 的消解，放射自显影后，ＤＮＡ梯度条带在相应于ＤＮＡ 结合蛋白的结合区中断，好像是蛋白质在ＤＮＡ上留下足纹，故得其名。EMSA可大致确定转录因子与靶ＤＮＡ 序列的结合位点，而无法确定转录因子与DNA结合的精确位置，足纹法则可弥补EMSA的这一缺点。在此基础上发展起来的固相足纹法就是用生物标记取代同位素标记靶DNA，结合反应和DnaseI酶解均可在固定于离心管壁的磁珠上进行。

3、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）

在研究转录因子时如果要使用这个方法，无异于在讲述丹麦童话中的故事－皇帝的新衣。只要没有纯真的孩童说出来，穿一穿这个新衣也无妨，但不要招摇过市。该方法的亮点就在于研究者可以在一念之间决定结果是阴性还是阳性。（备注：关于ChIP的深度博文将另行发表）

4、酵母单杂交系统（yeast one-hybrid system ）

酵母单杂交技术最早是1993年由Li等人从酵母双杂交技术发展而来的，其核心还是基于酵母转录因子Gal4的DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用的特性：GAL4的DNA结合结构域（BD）靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活序列(UAS)，而转录激活结构域（AD）可与RNA聚合酶亚单位以及其他共激活因子（Co-activator)相互作用，通过RNA聚合酶的激活而促进转录。这个方法有以下几个主要步骤：（1）质粒构建，要求3－5个核心结合序列拷贝串联于报告基因即刻上游，转化之前要进行线性化。Clontech公司新近推出不需要线性化的质粒，但从理论上和笔者的经验上来看，不推荐使用新版质粒，而推荐使用先前版本的质粒如pLacZi系列。因为老版本的质粒不能自主复制，线性化后转化酵母则整合到酵母基因组中随基因组的复制而复制，稳定性和重复性好。（2）酵母转化：已如前述。如果转录因子是异源二聚体，那么还得另外构建一个表达载体进行共转化。（3）报告基因分析和克隆鉴定。从这个过程可以发现该方法有以下优点：（1）它是一种体内实验方法（In Vivo）而不是体外法（In Vitro）；（2）将令人乏味的蛋白质操作转化为有趣的基因操作；（3）正如同酵母双杂交系统可以高通量进行筛库一样，酵母单杂交系统也可以用来筛选文库以获得未知的或新的转录因子克隆。值得一提的是，由于酵母是真核细胞，通过该系统获得的结果比其他体外方法获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。    据此，我们可将酵母双杂交系统中的GAL4的DNA结合结构域（DNA－BD）置换为目的蛋白（待研究的转录因子或候选转录因子），只要增加一个质粒构建将靶DNA结合系列UAS（通常为3－5个拷贝串联）连接到报告基因（LacZ，Luciferase，EGFP，His，Ade等）的上游，共转化酵母后，如果待研究的转录因子或候选转录因子与靶DNA结合序列相互作用，就同样可以通过Gal4转录激活结构域（AD）激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。基于这一理论，酵母单杂交系统主要应用于以下几个主要方面：（1）鉴定转录因子的活性；(2)鉴定转录因子靶序列；（3）界定转录因子的作用区域；（4）利用文库筛选来克隆新的转录因子。为了便于理解，泛基诺技术部特制作了以下模式图：

这是夏日最后的玫瑰，

独自绽放着，

所有昔日动人的同伴

都已凋落残逝。

（未完待续）

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