PCR克隆金牌Taq酶-高保真高效扩增的 FG

耐高温DNA聚合酶Taq的选择
 

耐高温DNA聚合酶的选择对于实验目的、实验的准确性、稳定性等均是成败攸关。从扩增的速率和忠实性来考虑, 耐高温DNA聚合酶可分为三类：
 

第一类：扩增效率高,但没有校正功能。该类聚合酶具有很强的从5’→3’方向合成DNA功能，但没有从3’→5’方向外切酶的活性。该类酶的合成效率高，但合成过程中出现的错误不能被有效纠正，我们的实验数据表明，在80%的克隆中，每一个kb会产生1～2突变。该类酶的代表就是普通Taq 酶（Taq DNA Polymerase），它扩增效率高，广泛应用于DNA片段大小的鉴定和菌落克隆鉴定，由于该酶尚能在合成的DNA的3’端羟基上加A，故而还用于PCR产物的T载体克隆。因该类酶不具有纠错功能，因而其扩增产物不宜用于基因突变检测和以基因表达及功能研究为目的之基因克隆。市售的所谓Platinum Taq 据称有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但笔者在美国做博士后研究期间用它来做批量克隆，测序结果发现其突变频率与普通Taq酶没有多少差别，对其印象深刻，因而它应被归类为普通Taq酶类。
 

第二类：既具有5’→3’方向合成DNA的功能，又具有3’→5’方向外切酶的活性和纠错功能，但DNA合成效率与普通Taq 酶相比大大降低。Pfu DNA 聚合酶便是这一类酶的代表，据称，Pfu的保真度在所有耐热DNA聚合酶中是最高的。我们以Pfu作为批量克隆中的工具酶，测序结果表明，0.8～1.5kb 的扩增片段，50%的克隆发现有突变；而1.8kb以上的扩增片段克隆中，突变的发生几乎无一幸免。
 

第三类：高保真高效率DNA聚合酶，兼有第一类和第二类酶的优点。从形式上看，将普通Taq 酶与Pfu DNA 聚合酶按一定比例混合即可（如Taq Plus），并为很多公司和客户所采用，但混合后由于二者对底物模板存在竞争性以及酶促反应动力学的紊乱而影响最终效果，于是，用基因工程的方法获得理想的第三类酶便成为PCR领域的一块研发高地。泛基诺科研人员，依其长期从事分子生物学基础研究之积淀，利用丙氨酸扫描技术鉴定出聚合酶和外切酶活性的最小结构域和相关的活性位点，进而用遗传学和基因工程方法获得既能高效扩增又具有很强的校正功能的金牌Taq （FG Golden Taq DNA Polymerase），稳定性高于普通 Taq酶，纠错功能强于Pfu (见下表)(更多的数据将在后续讲座中提供）
PCR产物克隆的基因
p53 NFKb HRAD17 SP1 ApoAIV eNOS SRC1 片段大小
1.2kb 1.7kb 2.0kb 2.4kb 1.3kb 4.4kb 4.2kb 获得无突变序列所筛选的克隆数
FG Golden
Taq
1
1
1
2
1
2
2
Pfu
2
3
3
4
2
NA＃ NA＃
＃备注： NA 代表Not Available