RNA干扰理论精要与实验指南

              RNA干扰理论精要与实验指南

 

【前言】RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能以及传染性疾病和恶性肿瘤的治疗。2006年， 安德鲁·法厄(Andrew Z. Fire,美国)与克雷格·C·梅洛(Craig C. Mello,美国)由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。最新研究表明，与 micro RNA（miRNA）类似，不仅其主链即前导链（Guide strand）在抑制靶基因表达过程中发挥重要作用，另一条链又称过客链（Passenger stand）也发挥重要的调节作用。RNA干扰实验有多种方法，实验者应根据自己的课题需要，认识每种方法的优缺点后选择适合自己的方法。

 

RNAi作用机制

 

病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

 

RNAi特点

 

1.高效性：Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1～100 nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。需要ATP：Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被 Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。

 

⒉特异性：Elbashir等和Brummel kamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。

 

⒊位置效应：Holen等根据人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。

 

⒋竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。

 

⒌可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。

 

制备方法

 

1.化学合成

 

许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。

 

最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。

 

不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。

 

2.体外转录

 

以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。

 

最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

 

不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

 

3.用RNaseⅢ消化长片断双链RNA制备siRNA

 

其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase Ⅲ (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。

 

dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse Ⅲ通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。

 

最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

 

不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

 

4.体内表达

 

前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。

 

siRNA表达载体

 

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol Ⅲ启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

 

siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。

 

病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。

 

最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。

 

不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。

 

RNA干扰主体实验

 

siRNA表达载体构建好后，即可进行RNA干扰主体实验。

 

RNA干扰主体实验的重点在于成功将siRNA表达载体导入目的细胞,如果目的细胞的质粒转染效率较低（低于70%），则应采用腺病毒或慢病毒载体，利用病毒载体的高感染率、高表达特性，更好地开展RNA干扰主体实验。

 

设置好分组和对照

 

按照nature的标准，一个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照：

 

⒈转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）；

 

⒉nonsense siRNA对照（监控外源核酸本身对结果的影响）；

 

⒊positive siRNA对照（监控假阴性）；

 

⒋技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利用至少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；

 

⒌Rescue 对照（knockdown之后做超表达，看是否有性状的逆转，这也是为了说明knockdown的特异性）；

 

6.全表达组扫描对照（就是转录/表达芯片扫描，以最终确定表型不是由于off-target造成）。

 

实际实验中，全表达组扫描对照很少有文献涉及。其它几个对照中，1,2两种对照即所谓的空白细胞对照、NC对照，基本是所有杂志都要求具备的。4,5两种对照，主要是为了解决off-target效应，选做一种即可，一般建议选5，涉及的实验即所谓的“RNA干扰回复实验”

 

应用

 

RNAi在探索基因功能中的应用

 

人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。

 

RNAi在基因治疗领域中的应用

 

RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。在利用RNAi技术对HⅣ-1、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。此外尚可通过使用肿瘤特异性启动子如hTERT启动子、survivin启动子或组织特异性启动子如酪氨酸酶启动子、骨钙素启动子引导针对某些癌基因或抗凋亡分子的siRNA或shRNA表达，从而达到特异性杀伤肿瘤细胞的目的。

 

RNAi在整形外科领域的应用前景

 

已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，其中66%的病例为BRAF激酶作用域突变。而约80%的BRAF突变病例是因胸腺嘧啶突变为腺嘌呤造成第599位的缬氨酸突变为谷氨酸所致。使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。

 

研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4证实该分子为原位移植肿瘤生长和转移所必需。此外，剔除BCRP表达可以逆转其介导的肿瘤耐药。

 

瘢痕疙瘩是一种较为难治的疾病，尚无有确切疗效的治疗方法。使用特异性siRNA剔除TGF-βⅡ型受体表达可以抑制角膜成纤维细胞表达纤维粘连蛋白并降低其迁移能力。剔除CTGF表达可使皮肤成纤维细胞内I型和Ⅲ型前胶原蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、组织金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）-1，TIMP-2和TIMP-3等基因表达水平降低。这些结果提示TGF-β信号转导通路和CTGF均可能是瘢痕疙瘩治疗的潜在靶点。

 

病毒性疾病的治疗

 

加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HⅣ-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞，而不影响另一种HⅣ-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HⅣ-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS）的防治研究中，RNAi也受到了重视。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗，RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

 

遗传性疾病的治疗

 

美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人发现RNAi同脆性X染色体综合征（与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病）之间的关系密切，揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。

 

肿瘤的治疗

 

肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。尽管化疗能有效消灭肿瘤细胞，却不能有效的靶向肿瘤细胞，因此在治疗过程中导致很多正常细胞的死亡，实现靶向肿瘤细胞同样也是以RNA干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。已有很多针对不同基因的RNA干扰在体内和体外有效的抑制了肿瘤细胞的生长，这些目的基因包括：B c l-2 、survivin、EGFR、VEGF 等。RNA干扰代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，能高效地特异性抑制目的基因。与传统的方法相比，RNA干扰技术设计更简便、作用迅速、效果明显，其技术优势还在于能根据不同病情，设计个体化治疗方案。