不同组织来源永生化细胞系的建立

               不同组织来源永生化细胞系的建立

 

各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。

 

一、体外培养细胞的种类和命名

 

体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。

 

（一）初代培养

 

初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。

 

（二）细胞系

 

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。

 

由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。

 

（三）克隆细胞株

 

从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）

 

（四）二倍体细胞

 

细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。

 

（五）遗传缺陷细胞

 

从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。

 

（六）肿瘤细胞系或株

 

这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。

 

对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今别举以下几种代表性的细胞名称供参考：

 

HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）

 

CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）

 

宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立

 

NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。

 

二、建立细胞系（或株）的要求

 

关于什么样的体外培养细胞群，可被确认为是已被鉴定的细胞（Certified  Cells），国际上也尚无统一的规定，一般依具体情况而定。在只用作初代培养细胞，只要供体性别、年龄等均一，取材部位及组织种类等条件稳定，做鉴定的项目无需很多，有几项能说明细胞的相关性状的即可。如能长期保存并可供其它研究室使用，特别是做反复传代的细胞，习惯上有以下一些要求，并在刊物上报道时应加以说明。

 

（－）组织来源

 

应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。

 

（二）细胞生物学检测

 

应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等实验。

 

（三）培养条件和方法

 

各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。

 

三、若干细胞建株的要点及基本过程

 

（一）肿瘤细胞培养技术要点

 

1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

 

2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。

 

排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

 

3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率

 

根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

 

（二）人类淋巴母细胞建株方法

 

l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。

 

2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。

 

3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。

 

4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。

 

5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。

 

6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。

 

7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。

 

8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。

 

9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1—2ml培养基，37℃培养10—15天，一般每隔3—4天观察一次，决定是否换液，传代。

 

10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。

 

四、已建立细胞系或株的鉴定、管理和使用

 

近些年，当一个细胞系或细胞林建成后，我国常通过组织专家开鉴定会的形式予以鉴定，从学术角度考虑，此举实非必要。按国际惯例，只要研究认真负责地把有关资料在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。

 

以前因未建立统一的细胞库时，对已建立的细胞系（株）多由作者单位自行保管，有浪费人力、交流使用不便、细胞易污染和丢失等弊病。我国已初建成小规模贮存细胞机构，待获进一步发展，这对我国细胞培养必将有更大促进作用。

 

国际上美、英和日本等国已建有细胞库；美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC下属有一组协作实验室和一个由众多专家组成的咨询委员会。ATCC也是美国国立癌症研究所（NCI）和美国卫生研究所中（NIH）的资源库，尤与NCI有密切的关系。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系（1992），其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系；和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费。） ATCC接纳入库细胞时，必须符合其入库标准， ATCC入库细胞要求检测项目如下：

 

培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等

 

冻 存 液：培养基和防冻液名称

 

细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性

 

培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量

 

细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性

 

核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无

 

无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等

 

物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测

 

免疫检测：一两种血清学检测

 

细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名

 

以上为ATCC入库基本要求，杂交瘤入库标准尚有所不同，详细情况请参阅ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”。