神奇的酵母遗传学(二) 酵母双杂交系统的前世今生

             神奇的酵母遗传学(二) 酵母双杂交系统的前世今生

                                                                作者： 泛基诺技术总监 胡恩泛

酵母遗传学对二十世纪九十年代以来的生命科学与医学研究产生了极大地推动作用，其威力之巨大、影响之深远、应用之广泛使得其他任何一种模式生物都不能望其项背。这一节主要讲述酵母双杂交系统原理的最新诠释和实验操作精要。

酵母遗传学对二十世纪九十年代以来的生命科学与医学研究产生了极大地推动作用，其威力之巨大、影响之深远、应用之广泛使得其他任何一种模式生物都不能望其项背。这一节主要讲述酵母双杂交系统原理的最新诠释和实验操作精要。

酵母实验操作在国内研究型实验室广为传播的主要原因还是酵母双杂交系统的应用和发展，关于酵母双杂交系统的原理，用 Google 或微软的搜索引擎bing（www.bing.com）去查找，这方面的文章俯拾皆是，但无论是新手上路还是导师专家，花几分钟的时间参阅下面由泛基诺技术总监撰写的内容，相信您还是能得到一些非常有用的信息，并在实际科研工作中有一定的借鉴作用。

酵母双杂交系统首先由Stan Fields实验室建立的，其原始出处参见1987年Cell杂志上的论文。该系统的理论基础是建立在对于酵母半乳糖代谢调控的两个关键转录因子Gal80负调控因子和Gal4正调控因子的功能解析上。

GAL4基因是酵母糖代谢中的一个重要基因，其编码的蛋白质Gal4（备注: GAL4表示基因，Gal4表示蛋白）具有两个结构域：位于N末端的DNA结合结构域(DNA-binding domain,简称BD)和位于C末端的转录激活结构域(transcription-activating domain,简称AD)。DNA结合结构域（BD）能识别GAL1基因启动子的上游激活序列（Upstream Activating sequence,UAS），转录激活结构域（AD）可同转录复合物的其他成分作用，启动GAL1基因的转录。GAL1基因上游含4个特殊序列UASg (upstream activator sequence-galactose)。每个UASg由17bp序列构成，当加入半乳糖作为诱导物后，Gal4可全方位的与GAL1的UASg结合，从而使GAL1基因的表达成千倍地增加。

Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A；将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒同时转化酵母（共转化），在泛基诺Trp Leu二缺培养基（Trp Leu Minus Media ）中筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺一缺培养基即缺Trp的培养基（英文Trp Minus Media，货号YGM003A-2）的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒，在二缺培养基即Trp Leu缺陷培养基（英文Trp Leu MinusMedia，货号YGM003A-7）的平皿中筛选转化克隆。无论是一次两个质粒共转化，还是两个质粒分别转化，最后都是在二缺培养基（一般是Trp Leu二缺）上筛选BD和AD融合的两个质粒。为什么用二缺筛选呢？因为Gal4-BD-A蛋白表达质粒含有色氨酸Trp合成标志基因，Gal4-AD-B蛋白表达质粒含有亮氨酸Leu合成标志基因，所以在缺乏色氨酸Trp和缺乏亮氨酸Leu的二缺培养基平皿中如果生长，就说明生长的酵母已经转化了两个质粒，而不能生长的酵母是因为没有转化进入两个质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建完整的Gal4转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性,增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。

1991年，我在美国做博士后期间, 老板从Stan Fields实验室获得原始材料，让我对菌株和质粒进行改造， 原始菌株是SCY90，实际上将它作为起始材料基本上没有任何用处，因为其中的标志基因已经没有选择的余地，只能从W303-1A/-1B系列或YPH499/500系列开始.。我试图从以下几个方面来改进：1）用不同的启动子序列代替单一的GAL1，并将上游激活序列用定点突变（SDM）的方法进行优化；2）用三报告基因（Ade2、His3、LacZ）替换单报告基因（LacZ）和双报告基因（LacZ，His3）。这些工作三言两语说得轻巧，可做起来却花费了我近两年的时间。要知道，我们还要将原始菌株中的编码Gal80和Gal4这两个基因敲除（注意：酵母基因敲出英文不用knock out，而是用deletion，所以中文描述应该是基因删除）。熟悉酵母分子遗传学操作的人都知道，删除酵母的某个基因时，需要在基因组中插入可供筛选的标志基因，但为了方便后续实验，即为保证最终获得的酵母报告菌株有较多的选择标志基因可用，还需要将先前插入的标志基因再删除以备后续实验研究中的质粒转化选择筛选，这些工作可是非常的time consuming！另外，当时定点突变采用的方法是Uracil选择法，该法费力耗时，可不像现在所采用的Strategene的SDM法简单快捷。在我走后又过了几年，双报告基因和三报告基因就先后商业化了，如Y187和AH109等（现在又升级到AH109-Gold）。

不久前，由于一个研究课题的需要，我用荧虫酶报告基因Luciferase将LacZ置换掉，原始材料分别选用Y187和AH109，在实验之前，需要对局部基因组区域测序收集有关信息，结果发现：Y187和AH109这两个酵母报告株每个报告基因的上游UASg序列与我当年用定点突变优化的组合序列竟完全一致，一个碱基也不差!！我真的不敢想这是否就是出自我当年之手。谈笑间，几十年过去，往事如梦，但一切又仿佛是在昨天,令人感慨万千! 有一首歌是怎么唱的来着？多年后终点又回到了起点--------二十年前酵母遗传学的副产品酵母双杂交系统如今在后基因组时代-蛋白质组研究中再次大放异彩。

 （写于2005年国际物理年  未完待续）