lncRNA研究策略

lncRNA研究策略

1) lncRNA筛选：

·       通过lncRNA芯片或RNA测序等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析；

·       通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA，构建共表达网络，预测lncRNA的靶基因；

·       通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证，确定其表达差异。

2) lncRNA确定：

·       通过5' RACE获取lncRNA 5'全长，3' RACE获取lncRNA3'全长，最终拿到完整的lncRNA序列。

3) 表达分析：

·       细胞水平表达：在细胞水平进行检测表达差异。

·       组织分布：检测不同组织、不同阶段表达特性。

·       表达水平动力学变化：比较不同处理条件下，如药物处理、诱导处理下，表达水平差异。

4) 功能研究：

·       功能获得性研究：构建lncRNA过表达载体:原则上是将全长lncRNA定向克隆到表达载体上实现lncRNA的过表达。然而有些lncRNA很大或全长尚未分离，这时将视lncRNA在基因组上的定位采取不同的研究策略。

·       功能缺失性研究：可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA，干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达的影响和对细胞表型如增值、凋亡、侵袭、转移等的影响；

·       采用RNA pull down、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation)、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。

·       采用lncRNA芯片分析技术结合mRNA对lncRNA功能进行预测，研究lncRNA trans和 cis作用机制。

·       采用配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，设计一种RNA配体，与癌症相关的lincRNA结合达到抑制肿瘤细胞的生长和转移。

·       采用快速预测RNA与蛋白质相互作用与结构域（catRAPID）在线算法来预测RNA与蛋白质的相互作用，该算法根据RNA和蛋白质的二级结构、氢键和分子作用力来评估它们之间的相互作用的倾向。

·       采用非编码RNA沉默和定位分析（c-KLAN）技术对lncRNA进行功能缺失（Loss-of-function）研究和细胞定位，该技术是在基于核糖核酸内切酶制备的小干扰RNA（esiRNA）和荧光原位杂交（FISH） 2种现有的研究方法的基础上建立起来的。

5) 表达调控：将lncRNA表达与其他领域相结合，解释lncRNA调控机理。

·       DNA甲基化：可通过检测相应基因甲基化差异与lncRNA结合分析。

·       转录因子：研究lncRNA与转录因子的调控机制。

·       染色质重塑：lncRNA表观调控。

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

ncRNA的作用机制很复杂，近年来不断更新，这也给lncRNA的功能增加了难度。当前很多通过研究miRNA与lncRNA的调控关系来揭示非编码RNA的功能，最热门的要数ceRNA调控网络。相关的可利用资源包括

（1）starBase平台（http://starbase.sysu.edu.cn/mirLncRNA.php） 构建了最全面的CLIP-Seq实验支持的miRNA和lncRNA的调控关系网络,包括构建了ceRNA调控网络（http://starbase.sysu.edu.cn/mrnaCeRNA.php）。

（2）DIANA-LncBase数据库（www.microrna.gr/LncBase）只是构建了基于单个CLIP-Seq数据的miRNA和lncRNA调控关系。