考马斯亮蓝R-250与G-250的区别

考马斯亮蓝R-250 与 G-250区别

【摘要】R250：一般用于染蛋白胶，染色后为红蓝色。G250：一般用于测蛋白浓度，也可染胶，染色后为蓝绿色，且特异性更高，但脱色较慢较难。

在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。它可分为考马斯亮蓝R-250和考马斯亮蓝G-250两类：

考马斯亮蓝R-250（Coomassie brilliant blue R250）C45H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。

考马斯亮蓝G-250(Coomassie brilliant blue G-250)又名Xylene brilliant cyanin G。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

两者比较：

1.结构：考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物；R250中的R代表Red，偏红。

考马斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。G250中的G就是Green，偏绿。

2 灵敏度：考马斯亮蓝R-250灵敏度比氨基黑高5倍；考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。

3.染色速度：R250属于慢染，脱色脱的完全；G250属于快染，脱色脱的不彻底。G250染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色最深，

4 用途：

（1）考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，考马斯亮蓝R250尤其适用于SDS-PAGE电泳微量蛋白质的染色。

（2）考马斯亮蓝R-250与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15—20ug），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系，常用于定量试验用

注意：蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。

（3）经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜,然后用脱色液脱色；染色液（0.1%考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇10% 冰醋酸

（4）考马斯亮蓝G-250优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。在进行小分子量蛋白的Tricine电泳是常用G250染色，

（5）R250一般染蛋白，G250一般测蛋白浓度，也可染胶，但脱色较慢较难。

（6）G250常作为定性试验用,染色后为蓝绿色；R250较敏感，常作为定量实验用,染胶效果较好，染色后为红蓝色。

附录：考马斯亮蓝R-250染色液配方

1、考马斯亮蓝R-250染色液配方

R-250 1.25g

冰醋酸 （MW:60.05）     50ml

甲醇                    225ml

去离子水                225ml

溶解后用滤纸过滤

2、脱色液配方：

冰醋酸          100ml

甲醇            300ml

去离子水        680ml

备注：

1、电泳完毕后用蒸馏水漂洗凝胶两次，每次2分钟，此步目的是洗去残留SDS，可降低染色背景。

2、染色的时间至少要0.5-1小时，染色过夜可增加微量蛋白的染色，提高灵敏度。回收染色液用十几次没问题。

3、快速法：加入染色液100ml，加盖微波加热（短暂煮沸），振摇染色5-10 min，回收染色液，自来水漂洗一次，加脱色液50-100ml，脱色10-20min，观察。整个过程不超过40min，过夜染色非必须。