GST Pull-down Protocol

GST Pull-down Protocol

一、溶液准备

1、PBS液

PBS (1L)

NaCl：         8g

KCl：          0.2g

Na2HPO4：     1.44g

KH2PO4：      0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，高温高压灭菌！4℃保存备用！

2、STE Buffer 

150 mM NaC1, 10mM Tris pH7.8, 1mM EDTA

（备注：此缓冲液在临用时加高浓度的母液Triton X-1000和DTT，使得最终浓度为1% Triton X-100, 1mM DTT ,1mM PMSF)

3、PMSF储存液 ：母液浓度200mM 乙醇溶液

4、1M DTT

5、10% Triton X-100

6、10% Sarkosyl

7、1M NaC1，0.5 M NaC1

二、实验

1.将pGEX-A表达质粒（质粒构建见分子克隆部分）转化大肠杆菌JM109或DH5α

2.挑起单个菌落克隆置于5ml LB+Amp（Amp 100ug/ml）于摇床内37C 37℃震荡培养（180-200rpm/min）过夜

3.次日转移至200ml LB+Amp震荡培养至OD600=0.8～1.0时，将温度降至30℃或室温，加IPTG至终浓度为1mM，震荡培养诱导蛋白表达3-5小时（备注：上述体积一般用于大量实验研究，在一般实验和教学中可将上述提及缩小到50ml，以下各步操作相应的其他实际用量也缩小相同的倍数）

4.3000g,4℃离心10min 收集菌体

5.细菌沉淀(源于500ml培养液)用10ml（教学实验缩小到1ml，以下各步不再说明）冰冷的PBS洗一次（重悬混匀），3000g离心10min,弃去PBS液。如果不方便继续完成后续实验，此时可将细菌沉淀置-80℃冻存，随后冰上溶解细菌沉淀继续下述实验步骤

6. 加10ml 冰冷的STE重悬细菌沉淀后，再加100ul 1M DTT,1ml 10% TritonX-100，50ul 200mM PMSF,彻底混匀，30秒间歇超声粉粹，超声总时间2min（注意用于教学实验的体积缩小倍数）

7.13000离心20min，收集上清！（注意：不是弃上清！）将上清转移到一个1.5ml 的离心管内，每管1ml。在每管中加入预先用 PBS洗涤过的GST磁珠或GST 琼脂珠子 1ml，补加100ul PMSF（备注：实验小组每组一管，注意缩小体积！）

8、在4℃下进行摇摆结合反应0.5～1 h

9、将上述结合反应管插到磁力架上，吸出上清（如果没有磁力架，可以200rpm离心3min ）

10、每管加0.6ml 1M NaC1,6ul 100mM PMSF 洗10min（水平摇摆）后放在磁力架上弃去上清

11、每管加0.6ml 0.5M NaC1,6ul 100mM PMSF 洗10min（水平摇摆）后放在磁力架上弃去上清

12、每管加0.6ml 0.5M NaC1,6ul 100mM PMSF 洗10min（水平摇摆）后放在磁力架上弃去上清

13、至此，GST pull-down的A蛋白铆定材料准备完毕。对于从事相关研究工作的实验者来说，下面的实验方案可供选择：

A.将GST-A融合蛋白磁珠与经兔网织红细胞体系翻译的同位素标记的B蛋白进行结合反应1h，洗三次后加Loading buffer, 煮沸1min上样电泳，真空干燥后压X-光片进行放射自显影。

B.在细菌中表达B蛋白（方法和实验操作同本实验），将GST-A与B进行结合反应后电泳、转膜、抗体检测（Western blot）。

C.将GST-A磁珠与人或动物细胞裂解液进行结合反应后行Western blot（有关应用的理论知识放在实验过程中的等待或休息时间讨论，如果主讲老师忘了讲授，请学员们提醒一下主讲老师）。

备注：GST-A蛋白与B蛋白的结合反应与洗涤与上述制备GST-A锚定材料的实验操作过程一样

附录：GST蛋白分子量

pGEX载体中GST自身的分子量有多大？26KD

空载体表达的GST为29kDa

融合时，GST部分为26kDa

MVDTESPICPLSPLEADDLESPLSEEFLQEMGNIQEISQSIGEE SSGSFGFADYQYLGSCPGSEGSVITDTLSPASSPSSVSCPVIPASTDESPGSALNIEC

                     RICGDKASGYHYGVHACEGCKGFFRRTIRLKLVYDKCDRSCKIQKKNRNKCQYCRFHK

                     CLSVGMSHNAIRFGRMPRSEKAKLKAEILTCEHDLKDSETADLKSLGKRIHEAYLKNF

                     NMNKVKARVILAGKTSNNPPFVIHDMETLCMAEKTLVAKMVANGVEDKEAEVRFFHCC

                     QCMSVETVTELTEFAKAIPGFANLDLNDQVTLLKYGVYEAIFTMLSSLMNKDGMLIAY

                     GNGFITREFLKNLRKPFCDIMEPKFDFAMKFNALELDDSDISLFVAAIICCGAPSKNG

                     GPSAAGHGACAARTGHQEDRVRRSAAPTVARDLQRHVLIFPEMAGRCHCSGTSEACGP