真核生物转录因子及其研究方法进展

     真核生物转录因子及其研究方法进展

真核生物基因表达是一个十分复杂而有序的过程，它是众多的反式因子和顺式作用元件之间相互作用的结果。基因的表达在各个层次上都受到精密的调控(包括染色体结构、转录、转录后、翻译和翻译后加工等水平的调控)；转录水平的调控发生在基因表达的初期阶段，是很多基因表达调控的主要方式之一。所谓转录水平的调控是指一类称为转录因子(transcription factor，TF)的蛋白质特异地结合到靶基因调控区的顺式作用元件上，或调节基因表达的强度，或控制靶基因的时空特异性表达，或应答外界刺激和环境胁迫。

真核细胞RNA聚合酶自身对启动子并无特殊亲和力，单独不能进行转录，也就是说基因是无活性的。因此，转录需要众多的转录因子和辅助转录因子形成复杂的转录装置。转录因子可以调控某些疾病相关基因转录水平，所以它可能成为潜在的治疗工具。

1、转录因子的结构

转录因子一般包括3个主要功能域，即DNA特定序列结合域、转录活化的结构域及蛋白质与蛋白质之间的调节结构域。另外，还有一些转录因子具有转录后调节结构域，如二聚化结构域和磷酸化位点，二聚体的形成对它们行使功能具有重要意义。转录因子与转录共激活子或转录共抑制子结合形成复合物，并与染色质上特异的DNA序列结合而发挥作用。一些小化学分子可以影响转录因子的二聚化作用或影响转录因子与DNA分子的结合，因此它们可以调节转录因子介导的基因表达调控。

1.1DNA结合域

DNA结合蛋白发挥其转录调控功能的首要条件之一是必须有与DNA序列特异结合的结构，其核心成分为DNA结合基序，它们可识别双螺旋DNA的碱基序列，与靶位点专一性结合。DNA结合域多由60个～100/个氨基酸残基组成的几个亚基组成。在DNA结合域的结构基序中，锌指结构、螺旋-突环-螺旋和亮氨酸拉链区最为普遗，约占已知转录因子的80%左右。

l.1.1锌指结构锌指结构(zinc finger motif)由大约30个氨基酸残基组成，其中含有两个半胱氨酸和两个组氨酸残基，这4个氨基酸与锌离子络合而形成稳定的指状结构。非洲爪蟾中由RNA聚合酶Ⅲ催化的5 S rRNA基因转录的转录因子TFⅢA(transcription factorⅢA)，是由344个氨基酸残基组成的第一个被发现的锌指蛋白。此后相继证实许多真核转录因子中存在锌指结构，但不同蛋白所含锌指结构的数量差异很大。

1.1.2螺旋-转角-螺旋结构基序螺旋-转角-螺旋结构基序(heilix-turn-helix，HTH)最初发现于研究真核细胞降解物基因活化蛋白CAP和噬菌体Cro阻遏物的过程中，是最简单的结构基序之一。果蝇同源异型基因编码的同源异型域(homeodomain，HD)蛋白是真核细胞中第一个被证实的螺旋-转角-螺旋蛋白，含HD结构的蛋白存在于从酵母到人几乎所有的真核细胞中。

1.1.3螺旋-突环-螺旋结构基序螺旋-突环-螺旋型DNA结合蛋白最近年来发现的一种新型DNA结合蛋白，如上游刺激因子是一种具有螺旋-突环螺旋基元的DNA结合蛋白，最初证明是腺病毒晚期基因的转录因子，后来发现在其他病毒和一些真核基因中也存在该结合位点。

1.1.4亮氨酸拉链结构基序在拉链区的氨基酸有30个残基的序列富含赖氨酸(1ysine，Lys)和精氨酸(arginine ,Arg)，是与DNA结合的碱性区域。因此亮氨酸拉链区的作用是将其自身的一对二聚体蛋白分子拉在一起，以便结合两个相邻DNA序列。含亮氨酸拉链的转录因子包括AP-1、fos、Jun、C/EBP和CREB。这些蛋白都通过亮氨酸拉链结构形成同种或异种二聚体，产生具有不同功能的特异转录因子而在转录调控中起作用。

l.2DNA激活域

这是与其他转录因子相互作用的结构成分，可控制前起始复合物的组装与转录起始。同一家族转录因子的可变区通常发生在激活功能域，通过可变区顺序的变异扩大调节范围。转录因子激活功能域主要有以下几种类型。

1.2.1酸性功能域该激活功能域含有较多酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)并能形成亲脂性α螺旋，是较常见的一种激活域。在糖皮质激素受体和AP-l/Jun转录因子中含有此种机构。

1.2.2富含谷氨酰胺功能域此结构首先发现于转录因子Spl。其结构特点是含约25%谷氨酰胺，主要出现在同源异形功能域或Pou类转录因子中。

1.2.3富含脯氨酸功能域此区域含20%～30%脯氨酸，脯氨酸是一种亚氨酸，可妨碍α螺旋的形成。这种结构在转录因子中较少见。

除具有DNA激活域外，有相当部分真核生物转录激活因子的活性状态为同源二聚体或异源二聚体，如亮氨酸拉链蛋白，不同组合方式赋予二聚体不同的识别功能，使单个激活因子参与多种基因的表达调控。

2、转录因子的分类

从功能上可将转录因子分为两类，即普遍性转录因子(general transcription factor，GTF)和激活转录因子(activation transcription factor)。

2.1普遍性转录因子

普遍性转录因子是转录起始复合物组成成员,主要功能是将RNA聚合酶定位在核心启动子上，为任何Ⅱ启动子起始转录所必需。真核生物DNA被包裹在染色质中，RNA聚合酶不能直接接触启动子，必需借助转录因子才能起始转录。目前已知至少发现6种以上GTF参与转录过程，最先结合到TATA框上的因子是TFⅡD，它是一种寡聚蛋白，包含TATA结合蛋白(TATA binding protein，TBP)和多种TBP联结因子(TAF)。TBP结台于双螺旋DNA的小沟使其弯曲约80o，以便于解链，其后TAF特异结合其上。作用于Ⅱ启动子的因子为TAFⅡ，含有不同TAFⅡ的TFⅡD可识别不同的启动子并与其结合；其后TFⅡA结合上去，以稳定TFⅡD与启动子的复合物。TFⅡF可与RNA多聚酶形成复合体，由两个亚基组成，大亚基RAP74具有依赖ATP的解旋酶活性，参与起点解链；小的亚基RAP38可与RNA多聚酶Ⅱ牢固结合。TFⅡB有两个结构域，一个结合TBP，另一个可引入TFⅡF/polⅡ复合物；TFⅡD也可和RNA聚合酶Ⅱ羧基端结构域(carboxy terminal domain，CTD)直接作用，使RNA聚合酶Ⅱ定位于转录起点。在聚合酶帮助下TFⅡE进入结合位点，并引入TFⅡH以提高活性。TFⅡH具有多种酶的功能，包括ATP酶、解旋酶和激酶，它的激酶活性能催化RNA聚合酶Ⅱ大亚基羧基端结构域的多个位点磷酸化，促使复合物改变构象而促进转录。

2.2激活转录因子

转录激活因子可影响转录起始复合物的组装及转录效率，决定某一基因是否表达。它们在真核生物基因的转录调控中占有十分重要的地位，是基因表达调控的核心内容之一。转录因子可以识别上游启动子元件，或者与增强子结合，直接地或借助其他蛋白质的接触来激活形成前起始复合物。转录激活因子一般含有两个结构域，即DNA结合域和激活结构域。

有些转录因子，如p300/CBP可以修饰组蛋白，因部分地影响核小体的形成，而非影响前起始复合物的组装；还有一些转录因子的作用是使DNA弯曲成一定的形状，使其他转录因子相互接触，共同形成一种增强体的结构协助转录，哺乳动物性别决定主控蛋白SRY(Y染色体上的性别决定区)即以这种方式工作。还有一些转录因子并没有DNA结合活性，只是通过与蛋白质之间接触的方式与前起始复合物作用激活转录。

3、转录因子的研究方法

在基因表达调控中，参与调控的转录因子是各种蛋白质，因此研究转录因子的一个主要内容就是研究蛋白质与DNA之间的相互作用。

3.1电泳迁移率改变分析

电泳迁移率改变分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)也称DNA迁移率变动试验，DNA在凝胶中的迁移率与相对分子质量及构型有关。裸露DNA与含有结合蛋白的DNA蛋白质复合物电泳时，裸露DNA迁移率主要取决于DNA本身，DNA蛋白质复合物由于体积较大而滞留在较后位置。这个方法首先用于大肠埃希菌乳糖操纵子中阻遏蛋白与其DNA结合位点的动力学研究。此技术的关键是将放射性同位素标记的DNA探针与核酸抽提物一起孵育，在非变性条件下直接电泳。其放射自显影图像的密度及面积即可放映易位至核内与DNA结合的蛋白的量，应用凝胶图像分析系统进行密度扫描，以扫描值作为蛋白的活性水平。该方法可以鉴定某种DNA结合蛋白以及这种蛋白与特异基因序列结合的能力。但由于许多转录调控蛋白有相同或相似的DNA结合位点，而且转录是涉及体内多种因素的复杂的网络调控过程，这种体外分析获得的结果不一定能真实的反应体内转录因子与DNA结合的状况。

3.2足迹法

凝胶阻滞试验可大致确定DNA序别中转录因子的结合位点，但却无法确定两者结合的淮确部位，而足迹法(foot printing)是一种能够测定DNA结合蛋白的精确结合位点的技术，其原理是DNA与蛋白质结合后，结合DNA部位收到蛋白质保护，使其结合位点免受Dnase I的降解，因而在放射自显影图谱上，DNA梯度条带在相应于DNA结合蛋白的结合区中断，恰似蛋白质在DNA上留下足迹。Okuno Y等研究发现Pul1的特异性表达受一个314 kb的DNA片段调控，这个片段具有一个位于转录起始点上游14kb处的DNA酶I超敏感位点，并发现上游调控序列对于PUll基因的特异性表达非常重要。

在此基础上发展起来的固相足迹法的原理是当含有蛋白质结合位点的DNA片段一端用生物素标记后，生物素和链霉抗生物素高度特异性的结合能快速有效地分离生物素标记的靶分子，从而使靶分子固定在包被有链霉抗生物素的磁珠上其后DNA与蛋白质结合，DNase I酶切均在DNA-磁珠复合物上进行，由于DNA磁珠复合物可以通过磁架固定在离心管壁上，因此称为固相足迹法。与传统的DNase I足迹法相比，不仅减少了对研究者的放射性损害，节省了时间，而且其过程可富集DNA结合蛋白，并且非特异结合的蛋白质能在洗涤过程中被淘汰掉，此方法能适应于未经纯化的核蛋白粗提物中DNA结合蛋白的研究。

3.3染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀技术(chromatin immunopre-cipitation，ChIP)近年被广泛用于研究体内转录调控因子与靶基因启动子上特异性核苷酸序列的结合，并已成为研究染色质水平基因表达调控的最有效的方法。基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

染色质免疫沉淀技术在其发展的早期仅仅用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰，近几年染色质免疫沉淀技术既可用于检测活体细胞中与DNA序列特异性结合的转录因子或转录协同因子，又可用于寻找和识别与转录因子结合的靶基因。Saksouk N等利用ChIP、DNA microarray技术证实组蛋白乙酰化和精氨酸三甲基化是弓形虫基因激活的标志；Cui L等利用ChIP、microarrayr、real-time PCR方法揭示在恶性疟原虫中乙酰转移酶在基因启动子区域组装介导组蛋白乙酰化作用并促进基因表达；Emma I等应用ChIP技术首次直接证明，在体内L EF3、P1143和IEl蛋白(杆状病毒的3种蛋白)能够紧密的结合在病毒染色质上，研究者由此推测，在感染细胞内，这3种病毒蛋白可能形成复制复合物调控病毒DNA的复制。

同时，ChIP可以广泛的与其他技术结合应用。Wei C L等用ChIP与PET(paired-end diTag，PET)相结合法研究了人类转录因子P53在整个人类基因组范围的结合位点，最终确定了最少542个P53精确结合位点(包括98个之前未发现的P53目标基因)，表明P53在肿瘤形成的初期有作用。Jothi R等利用染色质免疫沉淀法与测序法相结合鉴定了人CCCTC-binding factor的26814个结合位点，神经限制性沉默因子(nerve restriction slience factor，NRSF)的5813个结合位点和信号转导与转录激活子(signal transducer and activator of transcriptionl，STATl)的73956个结合位点。随着众多新靶基因的不断发现，人们对很多转录因子的功能有了进一步的认识，从而有助于我们了解基因表达的调控机制。

3.4染色质免疫沉淀DNA基因芯片

近几年来，ChIP与DNA芯片技术相结合，已经用于高通量筛选转录因子的靶基因以及分析靶基因在整个基因组中的分布情况。Buck M J等详细地介绍了ChIP-chip如何设计基因芯片、怎样选择实验对照以及使用什么分析工具来分析数据，从而为人们采用此项技术提供了依据。

2001年Iyer V R等应用ChIP-chip方法，在酵母中成功的鉴定了与细胞周期相关的转录因子SBF和MBF在酵母基因组上的结合位点的分布情况。2001年同一实验室的Lieb J D等发现了Rapl和Sir2，3，4等转录因子在酵母基因组上的分布情况，分辨率为2 kb。Simon I等研究酵母调控细胞周期表达的9个转录因子时观察到这些转录因子协同地调控细胞周期基因的表达，它们在细胞周期的不同阶段有不同的功能，因而细胞周期具有连续性。Lee T I等用c-myc抗原决定簇蛋白标记系统鉴定了酵母106个转录因子在基因组范围内的结合位点图谱，结果表明转录因子在调节真核细胞功能过程中起作用。

3.5生物信息学方法

通过生物信息学方法能分析大量DNA序列数据和基因表达产物，更加深入地解析基因与蛋白质的功能关系。生物信息学方法把基因组DNA序列信息分析作为起点，进行蛋白质、RNA等的结构模拟和功能预测及随之而来的药物设计。Liu Z等利用生物信息学方法测定了具有锌指结构的蛋白质与其相应的DNA之间的亲和力，测定结果与实验方法的结果具有很好的一致性。Tsai H K等构建了检测酵母结合位点(mining yeast binding sites，MYBS)的数据库，通过这个数据库可以鉴定每个转录因子的靶基因，同时可以作为进一步研究转录因子组合调控的起点。

目前，综合性转录因子结合位点的数据库已经建立，最常用的是TRANSFAC数据库，这个数据库从发表的文献中收集了转录因子、转录因子结合部位及结合部位序列信息。Horsman S等设计出一个BLAST搜索工具，称之为TF target mapper。此软件能够快速提取靶点附近基因的注解信息，有助于全面分析调控信息，并有利于弄清楚特异转录因子的作用机制，最终了解这些转录因子在生物体的哪些途径中发挥作用。

3.6 酵母单杂交

参阅博文：酵母单杂交系统：转录因子万花丛中的夏日玫瑰

博文链接：https://www.fungenome.com/newsinfo/1569392.html

4、小结

在真核生物中，转录因子调控的研究最活跃的是关于转录因子的研究。要揭示转录调节的机制，必须确定是哪些转录因子参与了转录，这些转录因子具有什么功能，如何进行自身的表达，与DNA元件如何作用并进行组装参与转录调控。随着新的实验技术的发展，人们将逐渐认识转录调控中的各种转录因子，确定其功能，从而进一步了解转录调控的机制。通过设计各种药物分子对其进行作用，抑制或激活这些因子，改变基因表达模式，对调控疾病的治疗具有重要的应用前景。

作者单位：(1.吉林大学人兽共患病研究所教育部重点实验室，吉林长春130062；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109)

来源：北京农业信息网