同源重组方法构建质粒实验指导

                       同源重组方法构建质粒实验指导 

【引物设计原则简单总结】
（1）前向引物：5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端
（2）反向引物：3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端
[可选 PCR 扩增条件]
(1)95℃：3min
(2) 35cycle
95℃：30s
55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物TM值降低5度）
72℃：40s
(3)72℃：10min
(4)16℃：hold
【特别要求注意】
PCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应
用于PCR扩增的模板DNA目标片段 5ng应该足够了（这与定量准确度有关）

【纯化后目的片段与线性载体进重组反应】
[可选重组体系]
5 × CE II Buffer   4 μl
线性化克隆载体     50～200 ng
片段扩增产物     20～200 ng
Exnase           2 μl
ddH2O           x ul
在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大减少了连接时间。
【详解】
基于同源基因重组原理，适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50 bp～10 kb 片段，同时构建时间也大大缩短。
1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化，线性化完全，假阳性克隆低。
2. 对于使用重组方式连接来说，PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列，通过 PCR 扩增方式进行连接，PCR 的产物要纯化！
【引物设计原则总结】
（1）前向引物：5’ 端--上游克隆载体末端同源序列+基因正向扩增引物--3’ 端
（2）反向引物：3’ 端--基因反向扩增引物+下游克隆载体末端同源序列--5’ 端
【可选 PCR 扩增体系】
ddH2O                 14 ul
10 x Taq buffer           2 ul
10 um DNTP              1 ul
10 um primer F           0.5 ul
10 um primer R           0.5 ul
Vector                 1 ul
Taq 酶                 1 ul
[可选 PCR 扩增条件]
(1)95℃：5min
(2) 35cycle
95℃：30s
55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根 据引物TM值降低5度）
72℃：40s
(3)72℃：10min
(4)16℃：hold
PCR 扩增后，通过胶回收方式获得纯化的 PCR 产物。纯化后的 PCR 产物不需要进行酶切，直接用于重组反应。
3. 目的引物与线性载体进行重组反应。
[可选重组体系]
5 × CE II Buffer         4 μl
线性化克隆载体          50～200 ng
插入片段扩增产物            20～200 ng
ExnaseII                2 μl
ddH2O                  x ul
在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于 37 ℃ 反应 30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。重组效率在反应 30 min 左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率，这样大大减少了连接时间。
4. 转化
将连接产物转化到受体菌中（一般为 DH5a），涂板，培养过夜。
5. 挑取单克隆，并鉴定
挑去平板上的单克隆培养，可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆，对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。
【几个主要注意事项】：
1. 载体克隆位点选择尽量选择无重复序列，且 GC 含量比较均匀的区域进行克隆。当克隆位点上下游 20 bp 区域内 GC 含量均在 40%～60% 范围之内时， 克隆效率将达到最大.
2. 最适克隆载体与插入片段摩尔比为 1:2，即最适插入片段使用量为 0.06 pmol。这些摩尔数对应的 DNA 质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng（0.03 pmol）
最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng（0.06 pmol）
3. 双酶切 1 和 2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及Activity in NEB buffer的问题