甲基化特异性PCR引物设计

                             甲基化特异性PCR引物设计 

甲基化特异性PCR(MSP)

1. MSP原理：MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描观察分析结果。

此原理的关键在于3对特异引物的设计。引物序列设计在富含胞嘧啶区域以区别亚硫酸氢钠处理后转化的非甲基化的DNA与未转化的甲基化的DNA，在引物的3’端，至少含有3个CpG位点，以保证区别甲基化与非甲基化DNA。野生型引物对直接根据基因组的待测序列设计。

甲基化引物对与非甲基化引物对分别根据待测序列的CpG位点甲基化与非甲基化时，经亚硫酸氢钠转化后的序列设计。野生型引物只能扩增出未经亚硫酸氢钠处理的基因片段，甲基化引物对与非甲基化引物对只能分别扩增甲基化与非甲基化的基因片段，由此达到检测基因甲基化的目的。

2. 亚硫酸氢钠处理DNA的具体方法

（1）在50ul体系中，DNA（2~5 μg）经NaOH（终浓度值0.2 mol/L）在37℃变性10 Min。对于ng级别的人基因组DNA，在进行修饰前加入2μg蛙鱼精DNA为载体。
（2）加入30 μl刚配制好的10 mmo/L 氢醌与520/1的40.5%亚硫酸氢钠混匀，之后石蜡油隔绝空气的条件下，避光在50%温育16 h。
（3）修饰后的DNA过WizerdDNA纯化柱，用50/1 L 水洗脱。室温下用NaOH（终浓度为0.3 mol/L）修饰5 min，之后用乙醇沉淀。
（4）DNA溶于20 μl 水中，立即使用或在-20℃保存。

3. MSP优点与缺点：与其他方法相比，MSP从非甲基化模板背景中检测甲基化模板的敏感性大大提高，是最敏感的甲基化测定方法。其缺点是需要两组已知的关键性CpG位点设计上下游引物，并且这些位点必须完全甲基化或完全不甲基化。事实上，能够完全满足这些条件的基因数目不多，该方法具有明显的基因“选择性”。在很多情况下，为了扩增到PCR产物，不得不降低退火温度，其后果是形成许多非特异性产物。随着退火温度的降低，该方法可靠性也随之下降。