BSP检测DNA甲基化经验分享

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1. Genomic DNA extraction
这一步其实也很重要,尤其是对tissue来说. 大家知道DNA hypermethylation会导致chromatin结构紧密, 所以这一步尽量去除DNA结合的蛋白很重要. 实验室常用Qiagen的kits效果都不是太好，最后还是用proteinase K处理后酚提、醇沉效果最好, 产率高纯度好.
2. bisulfite conversion
zymo research的methylation gold和Qiagen的epitech kit, 结果都不work…….当时自己买试剂按文献上的方法做，结果还是不好.。自己再琢磨, 这段DNA GC% 高, CpG很多(more than 200 within ~2000bp), 再看文献(尤其是近两年的, 有不少改进), 最后把bisulfite浓度和incubation time都加大, 然后就出来了。然后再用kit的试剂, 多run两个变性-转化的循环，结果也不错。

在BSP中genomic DNA的大小完整并不重要。为了变性完全，可以先用内切酶消化DNA过夜(必须选用在你的目的序列上没有切点的)再酚提醇沉，或者把DNA溶液通过注射器针头(26~27G)几次以打断DNA.检测转化是否完全，用正常的primers和BSP primers做PCR，全是BSP产物没有正常PCR产物基本完全了。

3. BSP
这一步还好，只要primer设计好了，PCR产物最好不要超过300bp否则比较难。另外，推荐一个网站: bisearch.enzim.hu, BSP相关primer design, 挺好, 最重要的是你可以search whole genome (human, mice, etc.)来确认非特异的结合和产物, 因为大部分C都转化成T之后，非特异的可能性大大增加(此处非广告)

还有，touch down PCR对BSP很好用(对所有的有false priming问题的PCR应该都有用)，一般从TA高几度开始到低5度结束，效果很好。

4. Sequencing

将PCR产物装到Invitrogen的TA vector里再送去测序(PCR必须用Taq)。室温连接5分钟, 然后转化， Kit里面建议的用量可以减半.