BSP/MSP具体操作步骤Protocol

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一、引物设计
1. 确定目的基因后，登陆网址：UCSC Genome Bioinformatics

2. 选网页左边的：Genome Browser后，进入基因检索界面

3. 在Assembly下拉菜单选择：Mar.2006

4. 在position or search term 输入基因名称，如APC后，submit

5. 在RefSeq 里面选择你的基因，如这里较多亚型时，最好参照您的NM_000000进行选择；如没有，调最长的isoform，点击之

6. 此时进入附图画面，在左边你可以看到标记蓝底的APC基因，点击之，进入下一界面

7. 在links to the sequence里面，选择Genomic sequence

8. 点击进入后，可在Promoter/Upstream by里面根据需要填个数值，比如500

9. submit 后进入基因系列

10. 大些字母处即为转录起始处，transcription start site，TSS

11. 从头开始，选定基因序列至完全涵盖TSS，可以长点，复制

12. 打开urogene

13. 在复制框里面黏贴

14. 选择你要的引物类型，如Bisulfite Sequencing，点击submit

15. 可看到参考引物，按你感兴趣的位点选择引物即可。引物的具体信息下面会有详细介绍。

二、BSP-亚硫酸盐修饰：
BSP 主要目的是，通过测定亚硫酸盐修饰后的DNA序列，了解特定基因的具体CpG位点的甲基化情况。而MSP只能获得该样本是否发生甲基化的信息，BSP则可以详细了解每一个CpG位点的甲基化情况。

1. 首先，按前帖设计引物后，确定BSP反应条件。一般做45个cycle。通常BSP的退火温度会比相应的MSP的退货温度低。

2. BSPCR后，取10ul跑PCR，如条带单一，则直接克隆，具体操作按照Invitrogen的TOPO试剂盒进行：如条带有杂带，需要进行PCR Screen，具体操作及原理不再赘述；

3. 克隆后在L+Amp平皿上，培养过夜后，后通常取8-12个克隆，液体LB+Amp培养过夜；

4. 过夜后LB液浑浊；按照Mini Plasmid DNA提取试剂盒操作说明，提取质粒DNA；

5. 半量反应后，送叫测序；

6. 测序结果报告用Chromas软件打开（或者FinchTV软件阅读，可用GOOGLE搜索后在线注册下载安装)，寻找出目的片段后，建立每一个克隆序列的TEXT文本（后续的BiQ Analyzer用这个文件导入）。

7. 将上述文件导入BiQ Analyzer后，按研究需要质控，最后生成BSP直观图。