研究蛋白-配体相互作用的STD-NMR技术

首页标题 ꄲ 生命科学 ꄲ 蛋白质方法 ꄲ 研究蛋白-配体相互作用的STD-NMR技术

饱和转移差谱(Saturation Transferred Difference，STD)的方法可以确定配体实际结合蛋白的部位，并可以从许多化合物的混合物中直接确定能结合到受体上的化合物及其结合力。蛋白等生物大分子包含着许多质子，这些质子之间存在偶极-偶极相互作用，造成自旋扩散效应。当我们选择性地照射蛋白中的一部分质子时，该质子的相干就会通过自旋扩散效应传递到整个蛋白中。通过分子间相互作用，相干也会传递到与蛋白结合的小分子上，使得小分子的NMR信号被部分饱和。由未经选择性照射的NMR谱和经过选择性照射的NMR谱得到差谱，就可以明确地筛选出能与蛋白结合的小分子的谱峰。STD方法原理见图。

也可以从另一个角度来理解这种现象：当蛋白的共振信号被选择性地饱和时，分子内的相干可通过NOE或自旋扩散效应在蛋白中传递，分子间的NOE转移也会发生。由于来自蛋白的负NOE的贡献，导致配体核磁共振信号强度的降低，通过差谱可以观测到这种信号降低现象。由于配体分子中各部分被饱和的程度不同，我们还可以据此确定小分子的抗原结合部位。STD谱的灵敏度取决于蛋白的大小、照射的时间长短、配体的解离速率，以及配体的过量程度。STD方法的一个主要优点是：这种方法可以与很多NMR脉冲序列结合，产生一系列的饱和转移差谱NMR实验，例如STD-TOCSY，STD-HSQC，等等。

饱和转移差谱（saturation transfer differenc，STD）实验原理如Fig 1所示：用圆形和三角形分别表示与蛋白有、无结合的配体，蓝色不规则形状代表蛋白大分子，分别做参照实验（off-resonance）（左图）和照射实验（on-resonance）（中图），在对照实验中，将选择性脉冲的照射频率设置在远离共振区的空白位置，即该脉冲对蛋白和配体均与干扰，此时，谱图中配体信号为I₀；在照射实验中，将选择性脉冲的照射频率设置在蛋白的部分质子共振频率上，该共振频率区无配体的共振信号，也就是说此时施加的选择性脉冲选择性地干扰蛋白信号而不干扰配体信号，蛋白的部分质子因该脉冲的作用而出现磁化饱和，磁化饱和现象因自旋扩散效应传递到整个蛋白质中，通过分子间相互作用，磁化饱和也会传递到与蛋白结合的配体上，使得配体的信号也被部分饱和，结合态配体和游离态配体交换，游离态配体也被部分饱和，谱图中配体信号为I_SAT；将对照实验和照射实验获得的谱相减，就获得STD差谱（右图），此时，与蛋白有结合的配体信号强度为：I= I₀-I_SAT，而与蛋白无相互作用的配体信号强度为0，这些配体信号在差谱中消失。

Fig 2和Fig 3给出了人血清白蛋白与水杨酸的STD谱，差别仅在于利用蛋白大分子横向弛豫时间短而对大分子信号进行了抑制。

Fig 1 饱和转移差谱STD示意图

Fig 2 人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）与水杨酸（salicylic acid）饱和转移差谱，使用watergate技术抑制水峰

Fig 3 人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）与水杨酸（salicylic acid）饱和转移差谱，使用watergate技术抑制水峰，通过自旋锁定的弛豫滤波技术抑制大分子信号。

饱和转移实验中，由于配体分子中各部分被饱和的程度不同，据此可以确定小分子的结合部位。STD谱的灵敏度与蛋白质大小、选择性脉冲照射时间的长短、配体的解离速率、配体与蛋白浓度比等等有关。STD实验要求蛋白较大，且解离常数介于100nM至10mM之间。

饱和转移实验能迅速而直观地检测与蛋白有结合的小分子，凡是在STD谱中出现的小分子，一定与蛋白分子有相互作用，而与蛋白没有相互作用的小分子，则不会出现在STD谱中。因STD实验检测易操作，且数据分析简单，因而在药物筛选中也占有一席之地。又因为STD能方便的与其他二维实验结合使用，如STD-COSY、STD-NOESY、STD-HSQC等等，产生一系列的2D STD差谱，能准确无误地再配体混合物中筛选出与蛋白结合的配体，这些2D STD差谱已经成为有标准的脉冲程序，可以直接调用。在滴定实验和竞争性结合实验中，也可以使用STD实验获得配体的结合常数，解离常数K_D也能通过数据分析获得，详细情况请参考文献：M. Mayer, B. Meyer, J. Am. Chem. Soc. 123(2001) 6108。